| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 1 绪论 | 第10-23页 |
| ·同源重组 | 第10-11页 |
| ·同源重组的分子模型 | 第10-11页 |
| ·RecA重组系统 | 第11-13页 |
| ·自杀性质粒载体的同源重组 | 第12页 |
| ·温敏型质粒载体的同源重组 | 第12-13页 |
| ·Red同源重组系统 | 第13-18页 |
| ·Red同源重组系统简介 | 第13-14页 |
| ·Red同源重组表达载体的发展 | 第14-15页 |
| ·Red同源重组的应用 | 第15-18页 |
| ·反向筛选标记(Counter-selectable Marker) | 第18-21页 |
| ·sacB | 第18-19页 |
| ·upp | 第19页 |
| ·ccdB | 第19-20页 |
| ·blaI | 第20页 |
| ·mazF | 第20-21页 |
| ·本论文思路 | 第21-23页 |
| 2 短同源臂介导的大肠杆菌upp基因的敲除 | 第23-34页 |
| ·材料与仪器 | 第23-25页 |
| ·菌种和质粒 | 第23页 |
| ·主要工具酶及化学试剂 | 第23页 |
| ·引物合成 | 第23页 |
| ·培养基和缓冲液的配制 | 第23-24页 |
| ·主要仪器设备 | 第24-25页 |
| ·实验方法 | 第25-31页 |
| ·实验流程 | 第25-26页 |
| ·大肠杆菌DH5α化学感受态细胞的制备和DNA转化 | 第26-27页 |
| ·Red基因的诱导表达和电转化感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| ·基因敲除打靶片段的扩增及回收 | 第28-29页 |
| ·电转 | 第29-30页 |
| ·突变菌种的筛选 | 第30页 |
| ·PCR验证 | 第30页 |
| ·卡那霉素抗性的消除 | 第30页 |
| ·PCR验证 | 第30-31页 |
| ·实验结果 | 第31-32页 |
| ·基因敲除打靶片段的回收 | 第31页 |
| ·第一次同源重组菌(DH5a-Δupp：：kanR)的PCR鉴定结果 | 第31-32页 |
| ·第二次位点特异性重组菌(DH5α-Δupp)的PCR鉴定结果 | 第32页 |
| ·讨论 | 第32-34页 |
| 3 长同源臂介导的大肠杆菌upp基因的敲除 | 第34-40页 |
| ·实验材料 | 第34页 |
| ·菌种和质粒 | 第34页 |
| ·主要工具酶和化学试剂 | 第34页 |
| ·引物合成 | 第34页 |
| ·培养基和缓冲液的配制 | 第34页 |
| ·实验方法 | 第34-36页 |
| ·大肠杆菌DH5α基组DNA的提取 | 第34-35页 |
| ·基因敲除打靶片段的扩增及回收 | 第35-36页 |
| ·电击转化 | 第36页 |
| ·PCR验证 | 第36页 |
| ·实验结果 | 第36-38页 |
| ·重叠延伸结果验证 | 第36-38页 |
| ·upp敲除PCR验证 | 第38页 |
| ·讨论 | 第38-40页 |
| 4 DH5α-△upp的应用 | 第40-55页 |
| ·实验材料 | 第40-41页 |
| ·菌种和质粒 | 第40页 |
| ·主要工具酶和化学试剂 | 第40页 |
| ·引物合成 | 第40页 |
| ·培养基及缓冲液的配制 | 第40-41页 |
| ·主要仪器设备 | 第41页 |
| ·实验方法 | 第41-46页 |
| ·DH5α和DH5α-△upp的生长曲线的测定 | 第41页 |
| ·DH5αDH5α-△upp的呼吸速率实验 | 第41-42页 |
| ·DH5α-△upp对5-氟尿嘧啶的敏感性实验 | 第42页 |
| ·SLiCE Cloning法构建质粒pRepCM3-iodoPheRS | 第42-45页 |
| ·非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶的正负筛选系统的构建 | 第45页 |
| ·非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶正负筛选系统的应用 | 第45-46页 |
| ·实验结果 | 第46-53页 |
| ·DH5α和DH5α-Δupp的生长曲线测定结果 | 第46-47页 |
| ·DH5α和DH5α-△upp的呼吸速率实验结果 | 第47页 |
| ·DH5α-Δupp对5-氟尿嘧啶的敏感性实验结果 | 第47-48页 |
| ·pRepCM3-iodoPheRS的构建 | 第48-52页 |
| ·非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶正负筛选系统的应用 | 第52-53页 |
| ·讨论 | 第53-55页 |
| 5 结论 | 第55-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-60页 |
