| 摘要 | 第1-19页 |
| ABSTRACT | 第19-22页 |
| 符号说明 | 第22-24页 |
| 第一章 前言 | 第24-41页 |
| 一、研究背景 | 第24-37页 |
| 1. 细菌的信号转导途径与第二信使(文献综述) | 第24-27页 |
| 2. c-di-GMP信号转导途径 | 第27-34页 |
| ·c-di-GMP信号转导的研究历史 | 第27-28页 |
| ·c-di-GMP的研究现状 | 第28-32页 |
| ·c-di-GMP的合成和分解机制 | 第28-29页 |
| ·c-di-GMP胞内浓度的调控 | 第29-32页 |
| ·通过输入结构域来进行活性调节 | 第30-31页 |
| ·通过EAL与GGDEF结构域串联调节 | 第31页 |
| ·通过改变酶的稳定性调节c-di-GMP的代谢 | 第31-32页 |
| ·通过控制酶的定位来调节c-di-GMP的代谢 | 第32页 |
| ·c-di-GMP的下游信号转导机制 | 第32-34页 |
| 3. GGDEF结构域的蛋白质的活性调节机制的研究现状 | 第34-35页 |
| 4. 群体感应效应(quorum sensing) | 第35-36页 |
| 5. 铜绿假单胞菌 | 第36-37页 |
| 二、研究内容、目的和意义 | 第37-41页 |
| 第二章 研究材料与方法 | 第41-59页 |
| 1. 菌株与质粒 | 第41页 |
| 2. 实验试剂和工具酶 | 第41-42页 |
| 3. 主要仪器 | 第42-43页 |
| 4. 实验流程和方法 | 第43-59页 |
| ·基因的克隆 | 第43-46页 |
| ·蛋白的表达纯化 | 第46-49页 |
| ·蛋白表达 | 第46-48页 |
| ·蛋白纯化 | 第48-49页 |
| ·晶体生长及数据收集 | 第49-50页 |
| ·晶体结构解析 | 第50-54页 |
| ·数据处理 | 第50-51页 |
| ·相位确定 | 第51-54页 |
| A. 同晶置换法 | 第52-53页 |
| B. 反常散射法 | 第53-54页 |
| ·模型搭建 | 第54页 |
| ·结构精修(Coot,phenix) | 第54页 |
| ·生化功能分析(酶活性测定-体内,体外) | 第54-59页 |
| ·DGC活性的体外测定 | 第54-56页 |
| ·DGC活性的细胞内测定--刚果红平板方法 | 第56-57页 |
| ·生物膜检测-比色法 | 第57-58页 |
| ·生物膜检测-盖玻片气液边界显微照相 | 第58-59页 |
| 第三章、实验结果 | 第59-139页 |
| 1. PA2771的克隆和蛋白的表达纯化 | 第59-81页 |
| ·PA2771-pGL01的表达纯化 | 第61-64页 |
| ·PA2771-pET21b的克隆表达纯化 | 第64-65页 |
| ·PA2771硒代蛋白的表达纯化 | 第65-67页 |
| ·PA2771突变体的克隆表达和纯化 | 第67-71页 |
| ·PA2771-R251A-Pg101的表达纯化 | 第67-68页 |
| ·PA2771-E262A,E263A-pGL01的克隆表达纯化 | 第68-71页 |
| ·PA2771单个结构域的克隆表达和纯化 | 第71-77页 |
| ·铜绿假单胞菌WSPR的克隆表达和纯化 | 第77-78页 |
| ·大肠杆菌Pyrophosphatase的克隆表达和纯化 | 第78-81页 |
| 2. 晶体的生长和优化 | 第81-84页 |
| ·PA2771 native晶体 | 第81页 |
| ·硒代PA2771的晶体 | 第81-82页 |
| ·PA2771-GTPγS复合物晶体 | 第82-83页 |
| ·PA2771与c-di-GMP的复合物晶体 | 第83页 |
| ·PA2771-N173-C end-pGL01结构域晶体 | 第83-84页 |
| ·PA2771-N173-Cend-pGL01结构域加GTP晶体 | 第84页 |
| 3. 数据收集和结构解析 | 第84-89页 |
| ·PA2771 native数据和硒代数据的收集和结构解析 | 第84-88页 |
| ·GGDEF结构域的数据收集和结构解析 | 第88-89页 |
| 4. PA2771的结构分析 | 第89-106页 |
| ·PA2771的整体结构 | 第89-91页 |
| ·PA2771的单体结构 | 第91-93页 |
| ·PA2771的二聚化分析 | 第93-102页 |
| ·PA2771的二聚化与c-di-GMP的结合 | 第99-101页 |
| ·PA2771在晶体中处于非活性二体状态 | 第101-102页 |
| ·单独GGDEF结构域的结构分析 | 第102-106页 |
| 5. PA2771酶活性调节模型 | 第106-139页 |
| ·PA2771全长及其GGDEF结构域的溶液中聚集状态的分析 | 第109-111页 |
| ·PA2771的DGC活性检测 | 第111-121页 |
| ·纯化的PA2771在体外具有DGC活性 | 第111-113页 |
| ·PA2771的酶活不受产物抑制调控 | 第113-114页 |
| ·PA2771在E.coli中具有DGC活性 | 第114-115页 |
| ·PA2771促进E.coli BL21的生物膜形成 | 第115-116页 |
| ·PA2771-GGDEF结构域的DGC胞内外活性测定 | 第116-121页 |
| ·GAF结构域的分析 | 第121-138页 |
| ·GAF结构域的结构分析 | 第121-125页 |
| ·PA2771结合的小分子的搜索 | 第125-138页 |
| ·Heme对PA2771结合及DGC活性的影响 | 第125-129页 |
| ·Biliverdin(胆绿素)对PA2771酶活力的影响 | 第129-131页 |
| ·FAD对PA2771的结合 | 第131-132页 |
| ·维生素E对PA2771的活性影响 | 第132-134页 |
| ·cGMP对PA2771的活性影响 | 第134-135页 |
| ·cAMP对PA2771活性的影响 | 第135-136页 |
| ·cmp对PA2771的结合 | 第136-138页 |
| ·PA2771酶活性调节模型总结 | 第138-139页 |
| 全文总结与展望 | 第139-140页 |
| 附录 | 第140-143页 |
| 参考文献 | 第143-152页 |
| 致谢 | 第152-153页 |
