| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-18页 |
| 缩略词 | 第18-20页 |
| 前言 | 第20-23页 |
| 第一章 文献综述 | 第23-53页 |
| 1 miRNA概述 | 第23-38页 |
| ·miRNA的发现 | 第23-24页 |
| ·miRNA的生物合成 | 第24-28页 |
| ·miRNA的基因组织形式 | 第24-25页 |
| ·miRNA的生物合成 | 第25-27页 |
| ·miRNA形成中植物与动物的区别 | 第27-28页 |
| ·miRNA的作用机制 | 第28-30页 |
| ·miRBase数据库 | 第30-32页 |
| ·植物miRNA的特点 | 第32页 |
| ·siRNA与miRNA | 第32-33页 |
| ·植物miRNA的功能 | 第33-38页 |
| ·miRNA与植物的生长发育 | 第33-35页 |
| ·miRNA与植物病害和应答环境胁迫 | 第35-36页 |
| ·miRNA与植物激素的调节及信号转导 | 第36-37页 |
| ·参与自身代谢的反馈调节 | 第37-38页 |
| ·参与ta-siRNAs的形成 | 第38页 |
| 2 miRNA的分离和鉴定方法 | 第38-50页 |
| ·遗传学筛选法 | 第38-39页 |
| ·小分子RNA克隆 | 第39-40页 |
| ·生物信息学预测法 | 第40-44页 |
| ·生物信息学预测miRNA | 第40-43页 |
| ·miRNA靶标的预测和鉴定 | 第43-44页 |
| ·高通量测序 | 第44-45页 |
| ·Northern杂交 | 第45-46页 |
| ·原位杂交 | 第46页 |
| ·基因芯片 | 第46-47页 |
| ·反转录聚合酶链式反应 | 第47-48页 |
| ·miRNA的命名 | 第48-49页 |
| ·果树miRNA的研究概况 | 第49-50页 |
| 3 展望 | 第50-53页 |
| 第二章 柑橘miRNA的生物信息学预测及其靶基因鉴定 | 第53-79页 |
| 1 材料和方法 | 第55-65页 |
| ·miRNA、ESTs和核苷酸序列 | 第55-56页 |
| ·应用的软件 | 第56页 |
| ·柑橘miRNA生物信息学分析和靶基因预测 | 第56-58页 |
| ·柑橘miRNA靶基因预测 | 第58页 |
| ·LMW RNA提取和Northern杂交 | 第58-61页 |
| ·化学试剂、酶制剂及试剂盒 | 第58-59页 |
| ·LMW RNA提取 | 第59页 |
| ·小分子RNA定量与完整性检测 | 第59-60页 |
| ·15%PAGE分离、转膜和固定 | 第60页 |
| ·寡核苷酸探针的制备 | 第60页 |
| ·杂交、洗膜、压片和放射自显影 | 第60-61页 |
| ·RLM-5'RACE验证miRNA对靶基因的剪切 | 第61-65页 |
| ·总RNA的提取 | 第61-62页 |
| ·5'端接头的连接 | 第62页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第62-63页 |
| ·RLM-5'RACE扩增 | 第63页 |
| ·RLM-5'RACE目的片段的回收 | 第63-64页 |
| ·目的片段与载体的连接 | 第64页 |
| ·采用CCMB80化学法制备感受态 | 第64-65页 |
| ·目的片段的转化及克隆鉴定 | 第65页 |
| 2 结果与分析 | 第65-76页 |
| ·柑橘中miRNA的预测 | 第65-72页 |
| ·柑橘miRNA靶基因的预测和主要功能分析 | 第72-74页 |
| ·新发现的miRNA的表达分析 | 第74-75页 |
| ·柑橘miRNA靶基因mRNA剪切的鉴定 | 第75-76页 |
| 3 讨论 | 第76-79页 |
| 第三章 利用miR-RACE确定生物信息学预测的枳的miRNA精确的序列 | 第79-101页 |
| 1 材料与方法 | 第81-84页 |
| ·实验材料 | 第81-84页 |
| ·植物材料 | 第81-82页 |
| ·菌株及载体 | 第82页 |
| ·化学试剂、酶制剂及试剂盒 | 第82页 |
| ·培养基及溶液 | 第82页 |
| ·引物 | 第82-84页 |
| ·生物信息学方法预测枳的miRNA | 第84页 |
| ·枳的靶基因预测 | 第84页 |
| 2 实验方法 | 第84-92页 |
| ·小RNA的提取 | 第84页 |
| ·小分子RNA定量与完整性检测 | 第84页 |
| ·小RNA 3'末端加ploy(A) | 第84-85页 |
| ·ploy(A)小分子RNA 5'接头的连接 | 第85页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第85-88页 |
| ·miR-5'RACE和miR-3'RACE扩增 | 第88页 |
| ·miRNA目的片段的回收 | 第88-89页 |
| ·目的片段与载体的连接 | 第89页 |
| ·目的片段的转化及克隆鉴定 | 第89页 |
| ·miR-RACE的可行性的进一步验证 | 第89-92页 |
| ·荧光定量PCR检测新的miRNA | 第92页 |
| 3 结果与分析 | 第92-99页 |
| ·枳miR-5'RACE和miR-3'RACE | 第92-94页 |
| ·枳miR-RACE扩增产物的克隆测序 | 第94-95页 |
| ·miR-RACE验证的枳miRNA保守和变异性分析 | 第95页 |
| ·枳miRNA的表达分析 | 第95-96页 |
| ·miR-RACE鉴定葡萄和苹果中的miRNA | 第96-97页 |
| ·枳miRNA靶基因mRNA剪切的鉴定 | 第97-99页 |
| 4 讨论 | 第99-101页 |
| 第四章 利用高通量测序发现枳中保守的和新的miRNA | 第101-129页 |
| 1 材料与方法 | 第103-107页 |
| ·实验材料 | 第103-104页 |
| ·植物材料 | 第103-104页 |
| ·化学试剂、酶制剂及试剂盒 | 第104页 |
| ·小RNA的提取 | 第104-105页 |
| ·小RNA cDNA文库的构建和测序 | 第105页 |
| ·5'端与3'端接头的连接 | 第105页 |
| ·逆转录 | 第105页 |
| ·cDNA文库的纯化和测序 | 第105页 |
| ·生物信息学分析 | 第105-106页 |
| ·枳的靶基因预测 | 第106页 |
| ·荧光定量PCR检测新的miRNA | 第106-107页 |
| ·新的miRNA剪切靶基因的鉴定 | 第107页 |
| 2 结果与分析 | 第107-124页 |
| ·枳小分子RNA的测序分析 | 第107-110页 |
| ·枳中保守的miRNA的鉴定 | 第110-111页 |
| ·高通量测序的miRNA与生物信息学预测的比较分析 | 第111-116页 |
| ·枳中新的miRNA的发现 | 第116-119页 |
| ·miRNA的检测和新的miRNA的表达特性 | 第119-121页 |
| ·枳中靶基因的预测 | 第121-122页 |
| ·枳miRNA靶基因mRNA剪切的鉴定 | 第122-124页 |
| 3 讨论 | 第124-129页 |
| ·枳中小分子RNA | 第124-125页 |
| ·枳中新的侯选的miRNA | 第125-126页 |
| ·枳的miRNA靶基因的预测和实验验证 | 第126-129页 |
| 第五章 枳不同发育时期不同器官的miRNA及其靶基因的表达分析 | 第129-175页 |
| 1 材料与方法 | 第131-141页 |
| ·miRNA靶基因电子克隆 | 第131页 |
| ·miRNA靶基因的克隆 | 第131-139页 |
| ·材料 | 第131页 |
| ·质粒、菌株和试剂 | 第131-138页 |
| ·RNA的提取与mRNA的纯化 | 第138页 |
| ·cDNA合成 | 第138页 |
| ·miRNA靶基因3'RACE和5'RACE | 第138页 |
| ·miRNA靶基因ORF的扩增 | 第138-139页 |
| ·miRNA靶基因的生物信息学分析 | 第139页 |
| ·亚细胞定位载体的构建 | 第139页 |
| ·亚细胞定位载体转化洋葱表皮细胞 | 第139-140页 |
| ·微粒子弹的制备 | 第139页 |
| ·轰击受体材料 | 第139-140页 |
| ·荧光定量PCR引物设计 | 第140页 |
| ·枳miRNA的表达分析 | 第140页 |
| ·枳miRNA靶基因的表达分析 | 第140-141页 |
| ·PPM-RACE和RLM-RACE分析枳miRNA剪切靶基因的产物 | 第141页 |
| ·数据分析 | 第141页 |
| 2 结果与分析 | 第141-168页 |
| ·枳miRNA靶基因的克隆和序列分析 | 第141-143页 |
| ·枳miRNA靶基因cDNA全长的电子克隆 | 第141页 |
| ·枳miRNA靶基因cDNA全长 | 第141-142页 |
| ·枳miRNA靶基因氨基酸序列分析 | 第142-143页 |
| ·枳miRNA靶基因的亚细胞定位 | 第143-146页 |
| ·qRT-PCR,PPM-RACE和RLM-RACE分析miRNA、靶基因和miRNA剪切靶基因的产物的表达分析 | 第146-168页 |
| ·PPM-RACE和RLM-RACE引物的特异性扩增检测 | 第147-148页 |
| ·枳miRNA的表达分析 | 第148-151页 |
| ·枳miRNA靶基因的表达分析 | 第151-157页 |
| ·miRNAs与其靶基因多数呈现负相关的表达特性 | 第157-159页 |
| ·枳miRNA剪切产物的表达分析 | 第159-168页 |
| 3 讨论 | 第168-175页 |
| ·miRNA的靶基因及其表达特性 | 第168-172页 |
| ·miRNA的表达特性 | 第172-173页 |
| ·miRNA在阶段转变中的作用 | 第173-175页 |
| 第六章 利用miR-RACE确定生物信息学预测的宽皮橘和甜橙的miRNA精确的序列和表达分析 | 第175-201页 |
| 1 材料与方法 | 第177-178页 |
| ·实验材料 | 第177页 |
| ·植物材料 | 第177页 |
| ·菌株及载体 | 第177页 |
| ·化学试剂、酶制剂、试剂盒及培养基及溶液 | 第177页 |
| ·引物 | 第177页 |
| ·宽皮橘和甜橙的miRNA和靶基因预测 | 第177-178页 |
| 2 实验方法 | 第178-182页 |
| ·小分子RNA的提取和质量检测 | 第178页 |
| ·用miR-RACE扩增宽皮橘和甜橙中的miRNA | 第178页 |
| ·宽皮橘和甜橙miRNA目的片段的回收、克隆和测序 | 第178页 |
| ·荧光定量PCR检测宽皮橘和甜橙的miRNA精确序列 | 第178页 |
| ·宽皮橘和甜橙的miRNA的靶基因的表达分析 | 第178页 |
| ·宽皮橘和甜橙的miRNA剪切靶基因的鉴定 | 第178-182页 |
| 3 结果与分析 | 第182-199页 |
| ·利用miR-RACE鉴定宽皮橘和甜橙的miRNA | 第182-185页 |
| ·miR-RACE验证的宽皮橘和甜橙的miRNA保守和变异性分析 | 第185-187页 |
| ·宽皮橘和甜橙的miRNA的表达分析 | 第187-190页 |
| ·宽皮橘和甜橙中miRNA靶基因的预测 | 第190-193页 |
| ·宽皮橘和甜橙的miRNA靶基因表达分析 | 第193-195页 |
| ·宽皮橘和甜橙的miRNA剪切靶基因表达分析 | 第195-197页 |
| ·宽皮橘和甜橙miRNA靶基因mRNA剪切的鉴定 | 第197-199页 |
| 4 讨论 | 第199-201页 |
| 第七章 柑橘中27个保守miRNA的鉴定和表达特性 | 第201-219页 |
| 1 材料和方法 | 第203-206页 |
| ·植物材料 | 第203页 |
| ·柑橘miRNA二级结构和靶基因预测 | 第203-204页 |
| ·LMW RNA提取和Northern杂交 | 第204-205页 |
| ·RLM-5'RACE验证miRNA对靶基因的剪切 | 第205-206页 |
| ·mRNA的纯化 | 第205页 |
| ·5'端接头的连接 | 第205页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第205页 |
| ·RLM-5'RACE扩增 | 第205-206页 |
| ·RLM-5'RACE目的片段的回收克隆与测序 | 第206页 |
| 2 结果与分析 | 第206-216页 |
| ·柑橘中miRNA的预测 | 第206-208页 |
| ·柑橘中miRNA的Northern鉴定和表达分析 | 第208-211页 |
| ·柑橘中miRNA的靶基因预测及主要功能分析 | 第211-215页 |
| ·柑橘miRNA靶基因mRNA剪切的鉴定 | 第215-216页 |
| 3 讨论 | 第216-219页 |
| 全文结论 | 第219-221页 |
| 主要创新点 | 第221-223页 |
| 参考文献 | 第223-239页 |
| 读博期间论文发表情况 | 第239-243页 |
| 致谢 | 第243页 |
