| 摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-17页 |
| 缩略词(Abbreviation) | 第17-20页 |
| 第1章 文献综述 | 第20-35页 |
| ·干扰素简介 | 第20页 |
| ·α-干扰素 | 第20-22页 |
| ·来源 | 第20-21页 |
| ·结构特征 | 第21页 |
| ·生物学功能 | 第21-22页 |
| ·体外生物学效应 | 第21页 |
| ·体内生物学效应 | 第21-22页 |
| ·α-干扰素受体 | 第22页 |
| ·临床应用 | 第22页 |
| ·β-干扰素 | 第22-23页 |
| ·β-干扰素的来源 | 第22页 |
| ·β-干扰素的结构特点 | 第22-23页 |
| ·β-干扰素的生物学活性 | 第23页 |
| ·体外生物学活性 | 第23页 |
| ·体内生物学活性 | 第23页 |
| ·β-干扰素的临床应用 | 第23页 |
| ·γ-干扰素 | 第23-25页 |
| ·γ-干扰素的来源 | 第24页 |
| ·γ-干扰素的结构特点 | 第24页 |
| ·γ-干扰素的生物学活性 | 第24页 |
| ·体外生物学效应 | 第24页 |
| ·体内生物学效应 | 第24页 |
| ·γ-干扰素的临床作用 | 第24-25页 |
| ·IFN及其相关基因的表达调控 | 第25-27页 |
| ·IFN的诱导 | 第25页 |
| ·IFN表达调控 | 第25-26页 |
| ·IFN激活基因的表达 | 第26-27页 |
| ·干扰素的作用机理 | 第27-30页 |
| ·IFN发挥作用的信号转导通路 | 第27-28页 |
| ·IFN信号的调节因素 | 第28-29页 |
| ·IFN的抗病毒作用机理 | 第29页 |
| ·PKR系统 | 第29页 |
| ·2′-5′寡腺苷酸合成酶/RNaseL系统 | 第29页 |
| ·Mx系统 | 第29页 |
| ·IFN的免疫调节机理 | 第29-30页 |
| ·猪干扰素的基因工程 | 第30-31页 |
| ·猪α干扰素的基因工程 | 第30-31页 |
| ·猪β干扰素的基因工程 | 第31页 |
| ·猪γ干扰素的基因工程 | 第31页 |
| ·细胞因子佐剂 | 第31-32页 |
| ·重组蛋白表达系统简述 | 第32-35页 |
| ·大肠杆菌表达体系 | 第33页 |
| ·酵母表达体系 | 第33-34页 |
| ·哺乳动物细胞表达系统 | 第34-35页 |
| ·质粒载体 | 第34页 |
| ·病毒载体 | 第34-35页 |
| 第2章 研究目的与意义 | 第35-36页 |
| 第3章 材料与方法 | 第36-59页 |
| ·试验材料 | 第36-45页 |
| ·质粒与菌株 | 第36页 |
| ·细胞、毒株与疫苗 | 第36-41页 |
| ·实验动物 | 第41页 |
| ·生化试剂 | 第41页 |
| ·主要培养基 | 第41-43页 |
| ·大肠杆菌培养基 | 第41页 |
| ·酵母培养基 | 第41-42页 |
| ·哺乳动物细胞培养基及消化液 | 第42-43页 |
| ·缓冲液 | 第43-44页 |
| ·质粒提取用缓冲液 | 第43页 |
| ·SDS-PAGE缓冲液及染液 | 第43-44页 |
| ·Western blot缓冲液 | 第44页 |
| ·E.coli感受态制备用试剂 | 第44页 |
| ·Pichia pastoris感受态制备用试剂 | 第44页 |
| ·ELISA缓冲液 | 第44-45页 |
| ·其它缓冲液 | 第45页 |
| ·试验方法 | 第45-59页 |
| ·猪外周血白细胞的分离及诱导培养 | 第45-46页 |
| ·猪γ-干扰素总RNA的提取 | 第46页 |
| ·RT-PCR扩增PoIFN-γ | 第46页 |
| ·RT-PCR扩增的引物序列 | 第46页 |
| ·RT-PCR反应体系 | 第46页 |
| ·RT-PCR反应条件 | 第46页 |
| ·RT-PCR产物的回收与纯化 | 第46-47页 |
| ·RT-PCR产物的克隆 | 第47页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第47页 |
| ·连接产物及质粒的转化 | 第47页 |
| ·重组质粒的快速鉴定 | 第47-48页 |
| ·PCR快速鉴定 | 第47页 |
| ·快速裂解鉴定 | 第47-48页 |
| ·质粒的制备 | 第48页 |
| ·质粒的小量制备(碱裂解法) | 第48页 |
| ·质粒的大量制备(碱裂解法) | 第48页 |
| ·干扰素的原核表达 | 第48-50页 |
| ·IPTG诱导表达 | 第48-49页 |
| ·包涵体提取 | 第49页 |
| ·表达产物的浓度测定 | 第49页 |
| ·SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 | 第49-50页 |
| ·干扰素多克隆抗体的制备 | 第50页 |
| ·免疫原的制备 | 第50页 |
| ·免疫程序 | 第50页 |
| ·干扰素的酵母表达 | 第50-54页 |
| ·重组质粒转化感受态毕赤酵母(LiCl法) | 第50-51页 |
| ·酵母重组基因组的提取(PCR模板制备) | 第51页 |
| ·酵母阳性重组子筛选(PCR) | 第51-52页 |
| ·重组酵母菌的诱导表达 | 第52页 |
| ·银染 | 第52页 |
| ·表达产物的Western blot检测 | 第52-53页 |
| ·猪干扰素生物活性的测定 | 第53页 |
| ·理化特性 | 第53-54页 |
| ·酵母菌株的保存 | 第54页 |
| ·干扰素的真核表达及其抗PRV作用 | 第54-55页 |
| ·质粒转染哺乳细胞 | 第54页 |
| ·间接免疫荧光(IFA)检测 | 第54页 |
| ·空斑减少试验 | 第54-55页 |
| ·病毒复制试验 | 第55页 |
| ·实时定量PCR(Real-time PCR) | 第55页 |
| ·重组腺病毒介导的猪α、β、γ干扰素的表达及其猪α干扰素抗PRRSV作用 | 第55-58页 |
| ·猪α、β、γ干扰素全长基因的亚克隆 | 第55-56页 |
| ·BJ5183细菌细胞电转化感受态的制备 | 第56页 |
| ·重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共同电转化BJ5183 | 第56页 |
| ·同源重组正确的质粒转化超级感受态XL10-Gold(?)细胞 | 第56-57页 |
| ·原代重组腺病毒的制备及其稳定性鉴定 | 第57页 |
| ·由rAd介导的PoIFN-α对PRRSV的抑制效果 | 第57页 |
| ·PoIFN-α降低PRSRV ORF7和Nsp9 mRNA的生成 | 第57-58页 |
| ·猪α、γ干扰素增强针对CSFV细胞苗(c-strain)的IgG及IgG2的抗体水平并调节Th1免疫反应 | 第58-59页 |
| ·特异性抗CSFV IgG抗体滴度的检测 | 第58页 |
| ·特异性抗CSFV IgG1和IgG2抗体滴度的检测 | 第58-59页 |
| 第4章 结果与分析 | 第59-103页 |
| ·PoIFN-γ的克隆及其原核表达 | 第59-63页 |
| ·PoIFN-γ全基因的克隆、测序及序列分析 | 第59-60页 |
| ·PoIFN-γ原核表达载体的构建 | 第60页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第60-61页 |
| ·融合蛋白最佳诱导时间的测定 | 第61-62页 |
| ·融合蛋白的可溶性分析 | 第62页 |
| ·Western blot分析及抗病毒活性 | 第62-63页 |
| ·PoIFN-α,PoIFN-β和PoIFN-γ的毕赤酵母表达 | 第63-73页 |
| ·PoIFN-α的毕赤酵母表达 | 第63-66页 |
| ·猪α-干扰素成熟蛋白基因的克隆 | 第63页 |
| ·表达质粒PoIFN-α的构建及鉴定 | 第63-64页 |
| ·重组mPoIFN-α酵母菌株的筛选 | 第64-65页 |
| ·SDS-PAGE及Western blot分析 | 第65-66页 |
| ·重组酵母猪α干扰素生物活性的测定 | 第66页 |
| ·理化特性 | 第66页 |
| ·PoIFN-β的毕赤酵母表达 | 第66-70页 |
| ·猪β-干扰素成熟蛋白基因的克隆 | 第66页 |
| ·重组穿梭质粒pPIC 9K-mPoIFNβ的构建与鉴定 | 第66-68页 |
| ·重组mPoIFN-β酵母菌株的筛选 | 第68页 |
| ·重组猪β-干扰素的诱导表达、SDS-PAGE及Western blot分析 | 第68-69页 |
| ·mPoIFN-β抗VSV病毒活性的检测 | 第69页 |
| ·mPoIFN-β理化性质 | 第69-70页 |
| ·mPoIFN-β抗FMDV病毒活性 | 第70页 |
| ·PoIFN-γ的毕赤酵母表达 | 第70-73页 |
| ·猪γ-干扰素成熟蛋白基因的克隆 | 第70-71页 |
| ·重组穿梭质粒pPIC 9K-mPoIFNγ的构建与鉴定 | 第71页 |
| ·重组mPoIFN-γ酵母菌株的筛选 | 第71-72页 |
| ·SDS-PAGE及Western blot分析 | 第72-73页 |
| ·mPoIFN-γ抗VSV病毒活性的检测 | 第73页 |
| ·PoIFN-α,PoIFN-β和PoIFN-γ在不同细胞系中的真核表达及其单独或联合作用对PRV增殖的抑制效果的比较 | 第73-85页 |
| ·PoIFN-α,PoIFN-β和PoIFN-γ真核表达质粒的构建 | 第73-75页 |
| ·间接免疫荧光检测PoIFN-α/β/γ在PK-15细胞中的表达 | 第75-76页 |
| ·PoIFN-α/β/γ在HeLa、MDBK、BHK-21、IBRS-2和PK-15细胞中的表达 | 第76-79页 |
| ·PoIFN-α/β/γ在MDBK和BHK-21细胞中mRNA水平的差异 | 第79-80页 |
| ·PoIFN-α/β、PoIFN-γ及其联合作用抑制PRV空斑形成 | 第80-82页 |
| ·PoIFN-α/β和PoIFN-γ联合协同抑制PRV的复制 | 第82-83页 |
| ·PoIFN-α/β和PoIFN-γ并不直接抑制PRV在IBRS-2细胞上的吸附 | 第83-84页 |
| ·PoIFN-α/β和PoIFN-γ抑制PRV IE mRNA的生成 | 第84-85页 |
| ·重组腺病毒介导的猪α、β、γ干扰素的表达 | 第85-98页 |
| ·重组腺病毒介导的猪α干扰素的表达 | 第87-92页 |
| ·重组猪α-干扰素穿梭载体的构建 | 第87页 |
| ·共转化BJ5183感受态后,同源重组的pAd-Sh-PoIFNα的鉴定 | 第87-88页 |
| ·原代重组腺病毒粒子的制备及其稳定性鉴定 | 第88-89页 |
| ·腺病毒介导的PoIFN-α抗VSV病毒活性的检测 | 第89-90页 |
| ·由rAd介导的PoIFN-α对PRRSV的抑制效果 | 第90-91页 |
| ·PoIFN-α降低PRSRV ORF7和Nsp9 mRNA | 第91-92页 |
| ·重组腺病毒介导的猪β干扰素的表达 | 第92-95页 |
| ·重组猪β-干扰素穿梭载体的构建 | 第92-93页 |
| ·共转化BJ5183感受态后,同源重组的pAd-Sh-PoIFNβ的鉴定 | 第93-94页 |
| ·原代重组腺病毒粒子的制备及其稳定性鉴定 | 第94-95页 |
| ·腺病毒介导的PoIFN-β抗VSV病毒活性的检测 | 第95页 |
| ·重组腺病毒介导的猪γ干扰素的表达 | 第95-98页 |
| ·重组猪γ-干扰素穿梭载体的构建 | 第95-96页 |
| ·共转化BJ5183感受态后,同源重组的pAd-Sh-PoIFNγ的鉴定 | 第96-97页 |
| ·原代重组腺病毒粒子的制备及其稳定性鉴定 | 第97-98页 |
| ·腺病毒介导的PoIFN-γ抗VSV病毒活性的检测 | 第98页 |
| ·猪α、γ干扰素增强针对CSFV细胞苗(C-strain)的IgG及IgG2的抗体水平并调向Th1免疫反应 | 第98-103页 |
| ·特异性抗CSFV的IgG抗体 | 第98-99页 |
| ·特异性抗CSFV的IgG1抗体 | 第99-100页 |
| ·特异性抗CSFV的IgG2抗体 | 第100-101页 |
| ·IgG2/IgG1比率 | 第101-103页 |
| 第5章 讨论与结论 | 第103-112页 |
| ·PoIFN-γ的表达 | 第103-106页 |
| ·PoIFN-γ基因的克隆 | 第103-104页 |
| ·PoIFN-γ的原核表达 | 第104页 |
| ·PoIFN-γ在P.pastoris中的表达 | 第104-105页 |
| ·PoIFN-γ在腺病毒表达系统中的表达 | 第105-106页 |
| ·PoIFN-α的表达 | 第106-107页 |
| ·PoIFN-α在P.pastoris中的表达及纯化 | 第106页 |
| ·PoIFN-α在腺病毒系统中的表达 | 第106-107页 |
| ·PoIFN-β的表达 | 第107-108页 |
| ·PoIFN-β在P.pastoris中的表达及纯化 | 第107-108页 |
| ·PoIFN-β在腺病毒系统中的表达 | 第108页 |
| ·干扰素抗病毒作用的研究 | 第108-110页 |
| ·腺病毒介导的PoIFN-α对PRRSV增殖效力的影响 | 第108-109页 |
| ·真核表达的PoIFN-α、PoIFN-β及PoIFN-γ对PRV增殖效力的影响 | 第109-110页 |
| ·猪α、β、γ干扰素对CSFV细胞疫苗的佐剂效应研究 | 第110页 |
| ·结论 | 第110-112页 |
| 参考文献 | 第112-124页 |
| 致谢 | 第124-125页 |
| 附录 | 第125-126页 |
