| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-39页 |
| 1 共生固氮的概念和意义 | 第12-14页 |
| ·微生物固氮的三种方式 | 第12页 |
| ·根瘤菌与豆科植物的相互作用过程 | 第12-13页 |
| ·根瘤菌中参与共生固氮的基因 | 第13-14页 |
| ·结瘤基因 | 第13-14页 |
| ·与根瘤菌细胞表面结构有关的基因 | 第14页 |
| ·固氮基因 | 第14页 |
| 2 豆科植物中参与共生同氮的基因 | 第14-20页 |
| ·参与宿主植物与根瘤菌相互识别的植物基因 | 第15-18页 |
| ·宿主植物对根瘤菌结瘤因子的识别 | 第15-16页 |
| ·宿主植物受体激酶基因 | 第16-17页 |
| ·结瘤因子激活的信号传导途径 | 第17-18页 |
| ·参与根瘤形成、发育的基因 | 第18-19页 |
| ·与固氮等氮代谢有关的基因 | 第19-20页 |
| ·与共生固氮相关的其他基因 | 第20页 |
| 3 共生固氮与自然环境的相互影响及作用 | 第20-28页 |
| ·共生固氮对自然界生态平衡及农业生产的意义 | 第20-21页 |
| ·影响共生固氮体系的环境因素 | 第21-24页 |
| ·水分 | 第22页 |
| ·氮素营养 | 第22-23页 |
| ·温度 | 第23页 |
| ·重金属 | 第23页 |
| ·其它环境因子 | 第23-24页 |
| ·盐胁迫对植物的生理影响及植物的应对机理 | 第24-28页 |
| ·盐胁迫对植物生理生化和生长发育的影响 | 第24-25页 |
| ·植物对盐胁迫的响应 | 第25-26页 |
| ·增强植物耐盐性的途径 | 第26-27页 |
| ·盐胁迫对豆科植物共生固氮功能的影响 | 第27-28页 |
| ·豆科植物结瘤素基因在应对环境胁迫中的作用 | 第28页 |
| 4 本研究室对紫云英中共生固氮相关基因的研究工作 | 第28-30页 |
| 5 实时荧光定量PCR技术原理及应用 | 第30-39页 |
| ·实时荧光定量PCR技术的原理简介 | 第31页 |
| ·实时荧光定量PCR技术的相关参数 | 第31-32页 |
| ·几种主要的荧光定量PCR技术 | 第32-35页 |
| ·荧光标记探针技术 | 第32-34页 |
| ·SYBR Green荧光染料法 | 第34-35页 |
| ·实时荧光定量PCR的参照物 | 第35-36页 |
| ·内参照 | 第35页 |
| ·外参照物 | 第35-36页 |
| ·荧光定量PCR参照物的选择 | 第36页 |
| ·荧光定量RT—PCR反应系统实验设计原则 | 第36-37页 |
| ·对扩增产物的要求 | 第36页 |
| ·引物的设计 | 第36-37页 |
| ·荧光定量PCR的应用 | 第37-38页 |
| ·基因表达的研究 | 第37页 |
| ·基因突变及其多态性 | 第37页 |
| ·转基因植物产品检测 | 第37-38页 |
| ·发展趋势及应用前景 | 第38页 |
| ·本论文拟开展的研究内容和意义 | 第38-39页 |
| 第二章 材料和方法 | 第39-54页 |
| 1 材料 | 第39-42页 |
| ·植物及微生物材料 | 第39页 |
| ·营养液与培养基配方 | 第39页 |
| ·胁迫处理用的无机盐母液 | 第39-40页 |
| ·常用贮存液和缓冲液配方 | 第40-41页 |
| ·主要分子生物学试剂 | 第41页 |
| ·主要耗材 | 第41页 |
| ·提取RNA用耗材和器皿 | 第41页 |
| ·荧光定量PCR用耗材 | 第41页 |
| ·主要仪器设备 | 第41页 |
| ·引物合成及测序 | 第41-42页 |
| 2 方法 | 第42-54页 |
| ·盆栽紫云英 | 第42-43页 |
| ·盆栽方法 | 第42页 |
| ·接种根瘤菌 | 第42-43页 |
| ·胁迫处理 | 第43页 |
| ·胁迫处理安排 | 第43页 |
| ·胁迫处理方法 | 第43页 |
| ·盆栽植株的共生固氮效应检测 | 第43-44页 |
| ·提取RNA | 第44-45页 |
| ·提取步骤 | 第44页 |
| ·总RNA的纯化 | 第44-45页 |
| ·Real—time PCR检测根瘤特异表达基因在胁迫下的表达特征 | 第45-49页 |
| ·Real—time PCR引物设计及检验 | 第45-46页 |
| ·普通RT—PCR | 第46-47页 |
| ·各胁迫处理样品的RNA浓度调整 | 第47页 |
| ·各待测基因在各胁迫处理中的表达特征检测 | 第47-49页 |
| ·对紫云英中若干共生固氮相关基因的克隆 | 第49-51页 |
| ·引物设计 | 第49-51页 |
| ·基因扩增 按TaKaRa公司试剂盒操作说明进行: | 第51页 |
| ·PCR产物的克隆与测序 | 第51-54页 |
| ·PCR产物回收 | 第52页 |
| ·PCR产物克隆 按pMD18—T载体说明书进行 | 第52页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第52页 |
| ·质粒小量提取 | 第52页 |
| ·阳性克隆的PCR验证 | 第52-53页 |
| ·测序与序列分析 | 第53-54页 |
| 第三章 结果与分析 | 第54-88页 |
| 1 紫云英在铵胁迫及盐胁迫下的共生固氮性状 | 第54-59页 |
| ·各对照组的共生固氮效应分析 | 第55页 |
| ·铵胁迫对共生固氮效应的影响 | 第55-56页 |
| ·盐胁迫对共生固氮效应的影响 | 第56-59页 |
| ·不添加额外氮源的盐胁迫 | 第57-58页 |
| ·添加额外氮源的盐胁迫 | 第58-59页 |
| ·小结 | 第59页 |
| 2 铵胁迫和盐胁迫对紫云英共生固氮相关基因表达的影响 | 第59-80页 |
| ·紫云英植株RNA样品的提取 | 第59页 |
| ·RNA样品的纯化和浓度调整 | 第59-60页 |
| ·对Real—time PCR引物的验证 | 第60页 |
| ·各样品RNA浓度的调整 | 第60-62页 |
| ·豆血红蛋白基因AsB2510在胁迫处理下的表达特征 | 第62-69页 |
| ·看家基因18SrRNA的标准曲线 | 第62-64页 |
| ·豆血红蛋白基因AsB2510的标准曲线 | 第64-66页 |
| ·AsB2510在各胁迫处理样品中的扩增曲线和融解曲线 | 第66-67页 |
| ·豆血红蛋白基因AsB2510在胁迫处理下的表达特征 | 第67-69页 |
| ·两个半胱氨酸蛋白(CCP)家族基因AsG2411和AsIIC2512在胁迫处理下的表达特征 | 第69-73页 |
| ·个半胱氨酸蛋白(CCP)家族基因的标准曲线 | 第69-71页 |
| ·两个半胱氨酸蛋白(CCP)家族基因在样品中的融解曲线 | 第71-73页 |
| ·转脂质蛋白(LTP)基因AsE246在胁迫处理下的表达特征 | 第73-76页 |
| ·转脂质蛋白(LTP)基因AsE246的标准曲线 | 第73-74页 |
| ·LTP基因AsE246在胁迫处理下的表达特征 | 第74-76页 |
| ·与结瘤素基因Nod3同源的AsIIA255在胁迫处理下的表达特征 | 第76-78页 |
| ·结瘤素基因Nod3同源的AsIIA255的标准曲线 | 第76-77页 |
| ·AsIIA255在样品中的融解曲线 | 第77页 |
| ·AsIIA255基因在胁迫处理下的表达特征 | 第77-78页 |
| ·小结 | 第78-80页 |
| 3 对紫云英中若干共生固氨相关基因的克隆 | 第80-88页 |
| ·对紫云英共生受体激酶基因的克隆 | 第80-84页 |
| ·对根瘤增强表达的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆 | 第84-85页 |
| ·对根瘤增强表达的二磷酸核苷酸磷酸酶基因的克隆 | 第85-87页 |
| ·小结 | 第87-88页 |
| 第四章 讨论 | 第88-103页 |
| 1 对铵胁迫及盐胁迫实验的讨论 | 第88-90页 |
| 2 对克隆的紫云英根瘤增强表达基因的讨论 | 第90-92页 |
| 3 要进一步进行的工作 | 第92-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 论文发表情况 | 第104页 |
