| 中文摘要 | 第1-8页 |
| 英文摘要 | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-12页 |
| 第一部分 产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的筛选 | 第12-21页 |
| 1.材料 | 第12-13页 |
| ·菌株 | 第12页 |
| ·试剂和药品 | 第12-13页 |
| ·仪器 | 第13页 |
| 2.方法 | 第13-15页 |
| ·试剂制备 | 第13-14页 |
| ·46株铜绿假单孢菌对亚胺培南耐药性分析 | 第14页 |
| ·金属酶表型筛选 | 第14页 |
| ·铜绿假单孢菌总DNA的提取 | 第14页 |
| ·PCR扩增 | 第14-15页 |
| ·琼脂糖电泳 | 第15页 |
| 3.结果 | 第15-17页 |
| ·亚胺培南对46株铜绿假单孢菌的MIC结果 | 第15-16页 |
| ·金属酶表型筛选结果 | 第16页 |
| ·PCR结果 | 第16-17页 |
| 4.讨论 | 第17-18页 |
| 参考文献 | 第18-21页 |
| 第二部分 铜绿假单孢菌所产VIM-2酶的序列分析、原核表达及纯化 | 第21-41页 |
| 1.材料 | 第21-23页 |
| ·菌株及质粒 | 第21页 |
| ·试剂和药品 | 第21-22页 |
| ·仪器 | 第22-23页 |
| 2.方法 | 第23-31页 |
| ·试剂制备 | 第23-25页 |
| ·铜绿假单孢菌总DNA的提取 | 第25页 |
| ·PCR扩增 | 第25-26页 |
| ·琼脂糖电泳 | 第26页 |
| ·PCR产物的回收纯化 | 第26页 |
| ·感受态细胞制备 | 第26-27页 |
| ·目的基因与T载体的连接 | 第27页 |
| ·转化 | 第27-28页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第28页 |
| ·酶切鉴定及测序 | 第28页 |
| ·pUCm-T／VIM-2重组质粒的构建 | 第28页 |
| ·pET-41b(+)／VIM-2重组质粒的构建 | 第28-29页 |
| ·pET-41b(+)／VIM-2重组质粒在大肠埃希菌中的表达 | 第29页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第29-30页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第30页 |
| ·重组蛋白的浓缩及含量测定 | 第30页 |
| ·重组蛋白的质谱鉴定 | 第30-31页 |
| ·重组菌MBL_(VIM-2)药敏测定 | 第31页 |
| 3.结果 | 第31-38页 |
| ·PCR结果 | 第31页 |
| ·pUCm-T／VIM-2重组质粒的酶切鉴定与序列分析 | 第31-34页 |
| ·pET-41b(+)／VIM-2重组质粒的酶切鉴定 | 第34页 |
| ·重组质粒pET-41b(+)／VIM-2的测序结果 | 第34-35页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达及纯化 | 第35页 |
| ·重组蛋白含量测定 | 第35-36页 |
| ·重组蛋白质谱鉴定 | 第36页 |
| ·重组菌MBL_(VIM-2)药敏结果 | 第36-38页 |
| 4.讨论 | 第38-39页 |
| 参考文献 | 第39-41页 |
| 第三部分 VIM-2酶的酶学特性 | 第41-56页 |
| 1.β-内酰胺类抗生素对VIM-2酶的稳定性及酶动力学研究 | 第41-47页 |
| ·材料 | 第41页 |
| ·药品与试剂 | 第41页 |
| ·仪器 | 第41页 |
| ·方法 | 第41-43页 |
| ·酶的制备 | 第41-42页 |
| ·确定各底物的最佳测定波长 | 第42页 |
| ·酶稳定性测定 | 第42页 |
| ·VIM-2酶的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)的求取 | 第42页 |
| ·pH、温度、底物浓度以及Na_2EDTA对酶活性的影响 | 第42-43页 |
| ·结果 | 第43-47页 |
| ·14种β-内酰胺类抗生素的酶稳定性结果 | 第43页 |
| ·VIM-2酶的动力学特征 | 第43-45页 |
| ·pH、温度、底物浓度以及Na_2EDTA对酶活性的影响 | 第45-47页 |
| 2.VIM-2酶等电点的测定 | 第47-51页 |
| ·材料 | 第47-48页 |
| ·试剂 | 第47页 |
| ·实验器材 | 第47-48页 |
| ·方法 | 第48-50页 |
| ·酶的制备 | 第48页 |
| ·nitrocefin鉴定β-内酰胺酶的活性 | 第48页 |
| ·分析性等电聚焦电泳测定VIM-2酶等电点 | 第48-50页 |
| ·结果 | 第50-51页 |
| ·nitrocefin鉴定β-内酰胺酶的活性 | 第50页 |
| ·等电聚焦电泳结果 | 第50-51页 |
| 3.讨论 | 第51-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 综述1 | 第56-61页 |
| 综述2 | 第61-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 | 第69页 |
