| 致谢 | 第1-6页 |
| 摘要 Abstract | 第6-9页 |
| KR在Pichia pastoris和E．coli中的表达 | 第9-36页 |
| 一、 材料与方法 | 第9-24页 |
| 1．1 材料 | 第9-13页 |
| 1．1．1 质粒及菌株 | 第9页 |
| 1．1．2 工具酶及试剂 | 第9-10页 |
| 1．1．3 质粒提取试剂 | 第10页 |
| 1．1．4 酵母电转化试剂 | 第10页 |
| 1．1．5 Southern Blotting | 第10-11页 |
| 1．1．6 SDS-PAGE电泳 | 第11-12页 |
| 1．1．7 酶活测定试剂 | 第12页 |
| 1．1．8 主要仪器 | 第12页 |
| 1．1．9 引物设计合成 | 第12-13页 |
| 1．2 方法 | 第13-22页 |
| 1．2．1 RT-PCR | 第13页 |
| 1．2．2 KR基因克隆到PBV220并转化大肠杆菌 | 第13-15页 |
| 1．2．3 大肠杆菌中蛋白的表达及产物的可溶性分析 | 第15页 |
| 1．2．4 SDS-PAGE电泳方法 | 第15-16页 |
| 1．2．5 KR基因克隆到pPIC9K和pPIC3．5K并转化GS115 | 第16-17页 |
| 1．2．6 Southern Blotting鉴定重组子 | 第17-19页 |
| 1．2．7 KR在GS115中的诱导表达 | 第19页 |
| 1．2．8 SDS-PAGE电泳 | 第19-20页 |
| 1．2．9 KR酶活测定 | 第20页 |
| 1．2．10 酶蛋白量的测定-Bradford法 | 第20页 |
| 1．2．11 KR的分离纯化 | 第20-21页 |
| 1．2．12 转化方法 | 第21页 |
| 1．2．13 转化产物的定性及定量分析-HPLC | 第21页 |
| 1．2．14 CHBE纯度鉴定 | 第21-22页 |
| 1．3 实验流程 | 第22-23页 |
| 参考文献 | 第23-24页 |
| 二、 结果与讨论 | 第24-35页 |
| 2．1 总RNA的制备 | 第24页 |
| 2．2 RT-PCR获取KR基因片段 | 第24-25页 |
| 2．3 PBV220-KR重组载体的构建及鉴定 | 第25-26页 |
| 2．4 KR在大肠杆菌中的表达 | 第26-27页 |
| 2．5 pPIC9K-KR和pPIC3．5K-KR重组载体的构建和鉴定 | 第27-28页 |
| 2．6 pPIC9K-KR和pPIC3．5K-KR线性化、电转化及诱导表达 | 第28-29页 |
| 2．7 酶的分离纯化 | 第29页 |
| 2．8 Southern分析 | 第29-30页 |
| 2．9 转化及酶活性测定 | 第30-35页 |
| 三、 展望 | 第35-36页 |
| 综述 | 第36-53页 |
| 一、 L-肉碱的概况 | 第36-38页 |
| 1、 L-肉碱的生理功能 | 第36-37页 |
| 2、 L-肉碱的生物合成 | 第37-38页 |
| 3、 L-肉碱的应用与市场前景 | 第38页 |
| 二、 立题依据 | 第38-41页 |
| 1、 手性化合物的重要性 | 第38-39页 |
| 2、 L-肉碱合成与拆分方法比较 | 第39-41页 |
| 三、 立题意义 | 第41-42页 |
| 四、 KR的研究概况 | 第42-43页 |
| 参考文献 | 第43-44页 |
| 五、 P．pastoris表达系统 | 第44-52页 |
| （一） P．pastoris表达载体的特点及构建 | 第45-46页 |
| （二） 表达载体的整合方式及转化子表型 | 第46-48页 |
| （三） 外源基因的分泌表达 | 第48-49页 |
| （四） 影响外源基因表达水平的因子 | 第49-52页 |
| （五） Pichia pastoris应用和展望 | 第52页 |
| 六 本研究所要达到的目标 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
