| 摘要 | 第1-23页 |
| ABSTRACT | 第23-30页 |
| 符号说明 | 第30-32页 |
| 第一章 前言 | 第32-65页 |
| 第一节 金属蛋白酶与恶性肿瘤 | 第33-36页 |
| ·金属蛋白酶 | 第33-34页 |
| ·金属蛋白酶与恶性肿瘤 | 第34-36页 |
| 第二节 组蛋白去乙酰化酶 | 第36-49页 |
| ·组蛋白去乙酰化酶家族 | 第36-38页 |
| ·组蛋白去乙酰化酶晶体结构 | 第38-39页 |
| ·组蛋白去乙酰化酶的主要生物学功能 | 第39-44页 |
| ·组蛋白去乙酰化酶抑制剂 | 第44-49页 |
| 第三节 氨肽酶N | 第49-61页 |
| ·氨肽酶N家族 | 第49-51页 |
| ·氨肽酶N已有的晶体结构 | 第51-52页 |
| ·氨肽酶N与肿瘤 | 第52-55页 |
| ·氨肽酶N抑制剂 | 第55-61页 |
| 第四节 基于结构生物学的合理药物设计 | 第61-65页 |
| ·结构生物学 | 第62页 |
| ·基于结构的药物设计 | 第62-65页 |
| ·确定靶点活性位点 | 第63页 |
| ·基于分子对接的虚拟筛选 | 第63页 |
| ·从头设计 | 第63-65页 |
| 第二章 人HDAC8和古菌属硫化叶菌APN的克隆,表达,纯化,蛋白晶体筛选以及酶理化性质研究 | 第65-103页 |
| 第一节 人HDAC8的克隆,表达,纯化与晶体筛选 | 第65-83页 |
| ·实验材料 | 第66-69页 |
| ·菌株、基因组与载体质粒 | 第66页 |
| ·试剂配置 | 第66-68页 |
| ·主要试剂与工具酶 | 第68页 |
| ·主要仪器 | 第68-69页 |
| ·实验方法 | 第69-74页 |
| ·基因克隆 | 第69-71页 |
| ·重组蛋白的表达及条件优化 | 第71页 |
| ·重组蛋白的分离纯化 | 第71-73页 |
| ·蛋白HDAC8晶体筛选与优化 | 第73-74页 |
| ·实验结果 | 第74-83页 |
| ·构建pGEX-6p-1-hHDAC8和pET21b-hHDAC8质粒 | 第74-75页 |
| ·重组蛋白质的诱导表达 | 第75-76页 |
| ·pGEX-6p-1-hHDAC8重组质粒表达的HDAC8的分离与纯化 | 第76-78页 |
| ·pET21b-hHDAC8重组质粒表达的HDAC8的分离与纯化 | 第78-81页 |
| ·HDAC8的蛋白晶体 | 第81-83页 |
| 第二节 人HDAC8的生化活性研究 | 第83-89页 |
| ·实验材料 | 第83-84页 |
| ·试剂 | 第83-84页 |
| ·主要仪器 | 第84页 |
| ·实验方法 | 第84-86页 |
| ·荧光分析法测定HDAC8活性并计算比活力 | 第84-85页 |
| ·一氧化氮供体GSNO,Cys-NO的合成及对HDAC8活性的影响 | 第85页 |
| ·Biotin switch法检测发生S-亚硝基化修饰的HDAC8 | 第85-86页 |
| ·实验结果 | 第86-89页 |
| ·原核重组表达的人HDAC8具有酶活性 | 第86页 |
| ·一氧化氮供体GSNO,Cys-NO及SNP对HDAC8活性的影响 | 第86-88页 |
| ·人HDAC8能够发生S-亚硝基化修饰 | 第88-89页 |
| 第三节 古菌属硫化叶菌APN的克隆、表达、纯化与晶体筛选 | 第89-97页 |
| ·实验材料 | 第89-90页 |
| ·菌株、基因组与载体质粒 | 第89页 |
| ·试剂配置 | 第89-90页 |
| ·主要试剂与工具酶 | 第90页 |
| ·主要仪器 | 第90页 |
| ·实验方法 | 第90-91页 |
| ·基因克隆 | 第90页 |
| ·重组APN的表达及条件优化 | 第90-91页 |
| ·重组APN的分离纯化 | 第91页 |
| ·古菌属硫化叶菌APN晶体筛选与优化 | 第91页 |
| ·实验结果 | 第91-97页 |
| ·构建pET15b-APN和pET21b-APN质粒 | 第91-92页 |
| ·重组APN的诱导表达 | 第92页 |
| ·重组表达APN的分离与纯化 | 第92-95页 |
| ·APN的蛋白晶体 | 第95-97页 |
| 第四节 古菌属硫化叶菌APN的生化性质研究 | 第97-101页 |
| ·实验材料 | 第97页 |
| ·试剂 | 第97页 |
| ·主要仪器 | 第97页 |
| ·实验方法 | 第97-98页 |
| ·比色法测定古菌属硫化叶菌APN活性 | 第97-98页 |
| ·古菌属硫化叶菌APN的最适温度与温度稳定性的测定 | 第98页 |
| ·古菌属硫化叶菌APN的最适pH与pH稳定性的测定 | 第98页 |
| ·实验结果 | 第98-101页 |
| ·重组表达的古菌属硫化叶菌APN具有氨肽酶活性 | 第98-99页 |
| ·古菌属硫化叶菌APN的最适温度与温度稳定性 | 第99-100页 |
| ·古菌属硫化叶菌APN的最适pH | 第100-101页 |
| 本章小结 | 第101-103页 |
| 第三章 HDAC8和APN抑制剂的筛选以及活性先导化合物的药效评价和机制研究 | 第103-143页 |
| 第一节 人HDAC抑制剂的筛选 | 第103-107页 |
| ·实验材料 | 第103-104页 |
| ·细胞株与试剂 | 第103-104页 |
| ·主要仪器 | 第104页 |
| ·实验方法 | 第104页 |
| ·荧光分析法测定化合物酶抑制活性 | 第104页 |
| ·MTT法测定化合物抑制肿瘤细胞增殖活性 | 第104页 |
| ·实验结果 | 第104-107页 |
| ·肉桂酰亚胺类及四氢异喹啉类化合物的酶抑制活性 | 第104-105页 |
| ·肉桂酰亚胺类及四氢异喹啉类化合物的抑制肿瘤细胞增殖活性 | 第105-107页 |
| 第二节 候选HDAC抑制剂5j的药效及机制研究 | 第107-127页 |
| ·实验材料 | 第107-108页 |
| ·细胞株与试剂 | 第107-108页 |
| ·主要仪器 | 第108页 |
| ·实验方法 | 第108-112页 |
| ·5j对各亚型HDACs的抑酶活性评价及分子对接 | 第108页 |
| ·Western blot法检测5j对组蛋白4乙酰化水平的影响 | 第108-109页 |
| ·MTT实验 | 第109页 |
| ·细胞周期分析 | 第109页 |
| ·细胞凋亡分析 | 第109页 |
| ·Western blot法检测凋亡通路相关蛋白的表达 | 第109-110页 |
| ·MDA-MB-231细胞的Caspase 3活性检测 | 第110页 |
| ·细胞划痕实验 | 第110页 |
| ·细胞侵袭实验 | 第110-111页 |
| ·人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立 | 第111-112页 |
| ·实验结果 | 第112-127页 |
| ·5j能显著抑制对各亚型HDACs的酶活性 | 第112-113页 |
| ·5j能显著诱导组蛋白4的乙酰化水平升高 | 第113-114页 |
| ·5j能显著抑制多种肿瘤细胞增殖 | 第114-115页 |
| ·5j能诱导乳腺癌细胞周期阻滞 | 第115-116页 |
| ·5j能诱导乳腺癌细胞凋亡 | 第116-118页 |
| ·5j影响细胞周期及凋亡相关信号通路蛋白的表达 | 第118-120页 |
| ·5j能显著抑制MDA-MB-231细胞的Caspase 3的活性 | 第120-121页 |
| ·5j能抑制MDA-MB-231细胞的MMP2的激活 | 第121页 |
| ·5j能抑制MDA-MB-231细胞的迁移 | 第121-123页 |
| ·5j能抑制MDA-MB-231细胞侵袭 | 第123-124页 |
| ·5j能显著抑制MDA-MB-231裸鼠移植瘤的生长 | 第124-127页 |
| 第三节 候选HDAC抑制剂D08系列的药效评价 | 第127-134页 |
| ·实验材料 | 第127页 |
| ·细胞株与试剂 | 第127页 |
| ·主要仪器 | 第127页 |
| ·实验方法 | 第127-128页 |
| ·D08对各亚型HDACs的抑酶活性评价 | 第127页 |
| ·MTT试验 | 第127页 |
| ·细胞周期分析 | 第127-128页 |
| ·人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立 | 第128页 |
| ·人结肠癌HCT116细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立 | 第128页 |
| ·实验结果 | 第128-134页 |
| ·D08系列对各亚型HDACs的抑酶活性结果 | 第128-129页 |
| ·D08系列能显著抑制多种肿瘤细胞增殖 | 第129页 |
| ·D08系列对MDA-MB-231细胞周期的影响 | 第129-130页 |
| ·D08a能显著抑制MDA-MB-231裸鼠移植瘤的生长 | 第130-132页 |
| ·D08a能显著抑制HCT116裸鼠移植瘤的生长 | 第132-134页 |
| 第四节 APN抑制剂的筛选及候选HW02的药效机制研究 | 第134-141页 |
| ·实验材料 | 第134页 |
| ·细胞株与试剂 | 第134页 |
| ·主要仪器 | 第134页 |
| ·实验方法 | 第134-136页 |
| ·APN抑制剂的虚拟筛选与候选化合物的酶活测定 | 第134页 |
| ·候选化合物HW02的酶抑制常数测定 | 第134-135页 |
| ·人肿瘤细胞测定候选化合物HW02的抑酶活性 | 第135页 |
| ·MTT试验 | 第135页 |
| ·细胞周期分析 | 第135页 |
| ·细胞凋亡分析 | 第135页 |
| ·细胞侵袭试验 | 第135-136页 |
| ·实验结果 | 第136-141页 |
| ·HW02具有较好的APN抑制活性 | 第136页 |
| ·候选化合物HW02的酶抑制常数 | 第136页 |
| ·HW02对人肿瘤细胞表面APN具有很强的抑制活性 | 第136-137页 |
| ·HW02能抑制多种肿瘤细胞增殖 | 第137-138页 |
| ·HW02诱导细胞周期阻滞 | 第138-139页 |
| ·HW02诱导细胞凋亡 | 第139-140页 |
| ·HW02抑制细胞侵袭 | 第140-141页 |
| 本章小结 | 第141-143页 |
| 全文总结与展望 | 第143-146页 |
| 参考文献 | 第146-161页 |
| 致谢 | 第161-162页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第162-163页 |
| 已发表的代表性论文 | 第163-183页 |
| 论文1 | 第163-177页 |
| 论文2 | 第177-183页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第183页 |
