| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 第一章 前言 | 第13-36页 |
| 1.1 α-淀粉酶的简介 | 第13-16页 |
| 1.1.1 α-淀粉酶、α-淀粉酶家族和糖苷水解酶 | 第13-14页 |
| 1.1.2 α-淀粉酶的结构和催化机制 | 第14-16页 |
| 1.2 微生物来源的α-淀粉酶的热稳定性研究 | 第16-27页 |
| 1.2.1 嗜热菌与嗜热酶 | 第16-18页 |
| 1.2.2 嗜热酶的特征 | 第18-19页 |
| 1.2.3 蛋白质的热稳定性类型和研究方法 | 第19-23页 |
| 1.2.3.1 蛋白质的热稳定性类型 | 第19页 |
| 1.2.3.2 蛋白质的热稳定性研究方法 | 第19-23页 |
| 1.2.4 a-淀粉酶的热稳定性特征研究 | 第23-27页 |
| 1.2.4.1 不同来源的a-淀粉酶具有不同的热稳定性 | 第23-25页 |
| 1.2.4.2 a-淀粉酶的B结构域和A、B结构域交界处与热稳定性相关 | 第25-26页 |
| 1.2.4.3 α-淀粉酶的B结构域 | 第26页 |
| 1.2.4.4 氨基酸组成和其他的结构特征 | 第26-27页 |
| 1.3 蛋白质工程进行酶热稳定性改造的研究进展 | 第27-30页 |
| 1.3.1 定向进化 | 第27页 |
| 1.3.2 理性改造 | 第27-30页 |
| 1.3.2.1 序列驱动的改造 | 第28页 |
| 1.3.2.2 基于结构的改造 | 第28-30页 |
| 1.3.2.3 稳定性预测 | 第30页 |
| 1.4 Anoxyballus sp.的研究概况 | 第30-33页 |
| 1.4.1 嗜热菌Anoxybacillus sp.的发现和分类 | 第30-32页 |
| 1.4.2 Anoxybacillus sp.来源的α-淀粉酶的研究 | 第32-33页 |
| 1.5 本论文的研究工作 | 第33-36页 |
| 1.5.1 研究目的与意义 | 第33页 |
| 1.5.2 主要研究内容 | 第33-34页 |
| 1.5.3 研究思路 | 第34-36页 |
| 第二章 材料与方法 | 第36-65页 |
| 2.1 材料 | 第36-41页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第36页 |
| 2.1.2 酶、药品、试剂和器材 | 第36-37页 |
| 2.1.2.1 实验用酶 | 第36页 |
| 2.1.2.2 主要药品 | 第36-37页 |
| 2.1.2.3 主要试剂和器材 | 第37页 |
| 2.1.3 仪器和设备 | 第37-39页 |
| 2.1.4 计算机硬件配置 | 第39页 |
| 2.1.5 主要培养基 | 第39-40页 |
| 2.1.6 主要引物 | 第40页 |
| 2.1.7 主要生物信息学工具和分析软件 | 第40-41页 |
| 2.2 实验方法 | 第41-65页 |
| 2.2.1 细菌总DNA的提取 | 第41页 |
| 2.2.2 细菌质粒提取 | 第41-42页 |
| 2.2.3 凝胶回收纯化 | 第42-43页 |
| 2.2.4 DNA纯化 | 第43-44页 |
| 2.2.5 DNA的酶切、连接体系 | 第44-45页 |
| 2.2.6 DNA的电泳及DNA片段浓度测算 | 第45页 |
| 2.2.7 质粒DNA的转化 | 第45-46页 |
| 2.2.8 SDS-PAGE蛋白质电泳 | 第46-47页 |
| 2.2.9 蛋白质浓度测定 | 第47-48页 |
| 2.2.10 产淀粉酶菌株的筛选和鉴定 | 第48-51页 |
| 2.2.10.1 产淀粉酶芽孢杆菌的筛选 | 第48页 |
| 2.2.10.2 产淀粉酶菌株的鉴定 | 第48-50页 |
| 2.2.10.3 进化树构建 | 第50-51页 |
| 2.2.11 α-淀粉酶基因的克隆和表达质粒构建 | 第51页 |
| 2.2.12 重组α-淀粉酶的表达、纯化和蛋白质浓度测定 | 第51-52页 |
| 2.2.13 无Ca~(2+)和含Ca~(2+)的α-淀粉酶AGXA的制备 | 第52页 |
| 2.2.14 α-淀粉酶的活性分析 | 第52-54页 |
| 2.2.15 圆二色谱分析 | 第54-55页 |
| 2.2.16 差示扫描量热分析 | 第55页 |
| 2.2.17 a-淀粉酶的同源建模和序列结构分析 | 第55-56页 |
| 2.2.18 分子动力学模拟 | 第56-58页 |
| 2.2.19 Ca~(2+)对AGXA的热稳定性影响 | 第58页 |
| 2.2.20 Zn~(2+)抑制AGXA的活性 | 第58-61页 |
| 2.2.21 酶的热稳定性改造 | 第61-65页 |
| 第三章 实验结果 | 第65-118页 |
| 3.1 产淀粉酶菌株的筛选和鉴定 | 第65-67页 |
| 3.1.1 产淀粉酶菌株的筛选 | 第65页 |
| 3.1.2 产淀粉酶菌株的鉴定 | 第65-67页 |
| 3.1.2.1 细菌总DNA提取纯化 | 第65-66页 |
| 3.1.2.2 16S rDNA PCR 扩増及纯化 | 第66页 |
| 3.1.2.3 16S rDNA基因的序列比对及构建系统发育树 | 第66-67页 |
| 3.2 α-淀粉酶基因的克隆、表达和纯化 | 第67-71页 |
| 3.2.1 a-淀粉酶基因的克隆和分析 | 第67-69页 |
| 3.2.2 表达质粒的构建，蛋白的表达和纯化 | 第69-71页 |
| 3.3 a-淀粉酶AGXA的酶学性质 | 第71-77页 |
| 3.3.1 无Ca~(2+)的AGXA的酶学性质 | 第71-74页 |
| 3.3.2 Ca~(2+)对AGXA的热稳定性的影响 | 第74-77页 |
| 3.4 AGXA的圆二色性分析 | 第77-84页 |
| 3.4.1 AGXA在常温下的二级结构 | 第77-78页 |
| 3.4.2 AGXA的变温测定 | 第78-84页 |
| 3.5 AGXA的差示扫描量热分析 | 第84-87页 |
| 3.6 AGXA的同源建模和结构分析 | 第87-94页 |
| 3.6.1 AGXA的同源建模 | 第87-92页 |
| 3.6.1.1 模板搜索与选取 | 第87-90页 |
| 3.6.1.2 使用Modeller构建目标序列的3D模型 | 第90-91页 |
| 3.6.1.3 模型评估 | 第91-92页 |
| 3.6.2 AGXA的模型结构分析 | 第92-94页 |
| 3.7 AGXA的分子动力学模拟 | 第94-99页 |
| 3.8 Zn~(2+)抑制AGXA活性的研究 | 第99-107页 |
| 3.8.1 Zn~(2+)对AGXA活性的影响 | 第99页 |
| 3.8.2 Zn~(2+)与AGXA相互作用的CD分析 | 第99-102页 |
| 3.8.3 组氨酸在蛋白质中的多重作用 | 第102-104页 |
| 3.8.4 Zn~(2+)与AGXA相互作用的分子动力学模拟 | 第104-107页 |
| 3.9 AGXA的热稳定性改造 | 第107-118页 |
| 3.9.1 突变位点的选取 | 第107-109页 |
| 3.9.2 虚拟氨基酸突变分析 | 第109-112页 |
| 3.9.3 突变实验 | 第112页 |
| 3.9.4 突变酶的酶学性质分析 | 第112-118页 |
| 第四章 讨论 | 第118-126页 |
| 4.1 AGXA为中等耐温的新型碱性α-淀粉酶 | 第118-119页 |
| 4.2 Ca~(2+)提高AGXA的热稳定性 | 第119-121页 |
| 4.3 Zn~(2+)抑制AGXA的活性 | 第121-123页 |
| 4.4 AGXA的热稳定性改造研究 | 第123-126页 |
| 4.4.1 突变位点选取 | 第123-124页 |
| 4.4.2 替换氨基酸的选择 | 第124-126页 |
| 第五章 结论与创新 | 第126-128页 |
| 5.1 结论 | 第126页 |
| 5.2 创新 | 第126-127页 |
| 5.3 展望 | 第127-128页 |
| 参考文献 | 第128-149页 |
| 附录 | 第149-160页 |
| 附录一 蛋白纯化用缓冲液 | 第149-150页 |
| 附录二 基因和氨基酸序列 | 第150-154页 |
| 附录三 Amber14计算的部分文件 | 第154-157页 |
| 附录四 用Gaussian 09计算的部分文件 | 第157-160页 |
| 致谢 | 第160-161页 |
| 攻读学位期间发表的论文和研究成果 | 第161-162页 |
