| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 英文缩略词表 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-32页 |
| 1 动物GDF8基因研究进展 | 第14-16页 |
| 2 基因编辑技术研究进展 | 第16-32页 |
| 2.1 锌指核酸酶技术 | 第16-19页 |
| 2.2 类转录激活因子样效应物核酸酶技术 | 第19-21页 |
| 2.3 CRISPR/Cas系统的研究进展 | 第21-32页 |
| 2.3.1 CRISPR/Cas系统的研究历史 | 第21-22页 |
| 2.3.2 CRISPR/Cas系统在基因编辑中的应用 | 第22-26页 |
| 2.3.3 在动物遗传育种方面的应用 | 第26-28页 |
| 2.3.4 在疾病治疗方面的应用 | 第28-32页 |
| 第二章 CRISPR/Cas9系统介导的兔GDF8基因编辑研究 | 第32-61页 |
| 前言 | 第32-33页 |
| 1 实验材料与仪器设备 | 第33-34页 |
| 2 主要溶液的配制 | 第34页 |
| 2.1 CCM溶液的配制 | 第34页 |
| 2.2 DMEM液的配制 | 第34页 |
| 2.3 0.25%胰蛋白酶消化液的配制 | 第34页 |
| 2.4 PBS液的配制 | 第34页 |
| 3 实验方法 | 第34-41页 |
| 3.1 构建gRNA真核表达载体并筛选高活性的gRNA结合位点 | 第34-37页 |
| 3.1.1 设计gRNA靶位点并构建gRNA真核表达载体 | 第35-36页 |
| 3.1.2 筛选具有高活性的gRNA靶位点 | 第36-37页 |
| 3.2 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑系统在兔成纤维细胞上的验证 | 第37-39页 |
| 3.2.1 电穿孔介导的DNA转染兔的成纤维细胞 | 第37-38页 |
| 3.2.2 提取转染后成纤维细胞的基因组 | 第38页 |
| 3.2.3 鉴定基因编辑细胞GDF8的基因型 | 第38-39页 |
| 3.3 体外转录获得hSpCas9 mRNA及sgNA | 第39页 |
| 3.4 兔的超数排卵及胚胎收集 | 第39-40页 |
| 3.5 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑系统在胚胎水平上的验证 | 第40页 |
| 3.6 GDF8基因敲除兔的生产 | 第40-41页 |
| 3.7 CRISPR/Cas9介导的仔兔基因突变的检测 | 第41页 |
| 4 结果与分析 | 第41-58页 |
| 4.1 兔GDF8基因编辑位点的筛选 | 第41-42页 |
| 4.2 兔GDF8基因编辑载体构建 | 第42-44页 |
| 4.3 兔GDF8基因编辑载体细胞转染及检测 | 第44-49页 |
| 4.4 兔GDF8基因编辑载体的流式细胞检测 | 第49-51页 |
| 4.5 兔胎儿成纤维细胞的培养和转染检测 | 第51-53页 |
| 4.6 CRISPR/Cas9介导的兔成纤维细胞GDF8的基因编辑 | 第53-54页 |
| 4.7 CRISPR/Cas9介导的兔胚胎GDF8基因编辑 | 第54-57页 |
| 4.8 GDF8基因编辑兔的生产与鉴定 | 第57-58页 |
| 5 讨论 | 第58-60页 |
| 6 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 攻读学位期间发表论文及专利 | 第66页 |
