| 摘要 | 第3-4页 |
| abstract | 第4页 |
| 缩略语表 | 第9-11页 |
| 1 引言 | 第11-20页 |
| 1.1 马立克氏病病毒与火鸡疱疹病毒的概述 | 第11-13页 |
| 1.1.1 马立克氏病病毒与火鸡疱疹病毒基因组结构及形态 | 第12页 |
| 1.1.2 马立克氏病病毒与火鸡疱疹病毒的复制 | 第12-13页 |
| 1.2 疫苗的概述 | 第13页 |
| 1.3 火鸡疱疹病毒作为病毒载体的优点 | 第13-14页 |
| 1.4 火鸡疱疹病毒作为活病毒载体的条件 | 第14-15页 |
| 1.4.1 构建外源基因表达盒 | 第14页 |
| 1.4.2 复制非必需区的选择 | 第14-15页 |
| 1.4.3 启动子的选择 | 第15页 |
| 1.4.4 重组火鸡疱疹病毒的研究进展 | 第15页 |
| 1.5 同源重组技术 | 第15-16页 |
| 1.5.1 同源重组技术的概况 | 第15-16页 |
| 1.5.2 同源重组技术的发展历史 | 第16页 |
| 1.6 CRISPR系统的介绍 | 第16-18页 |
| 1.6.1 CRISPR系统的结构 | 第16页 |
| 1.6.2 CRISPR系统的类型 | 第16-17页 |
| 1.6.3 CRISPR/Cas9编辑技术的介绍 | 第17-18页 |
| 1.6.4 CRISPR/Cas9系统的应用 | 第18页 |
| 1.7 本试验研究目的意义 | 第18-20页 |
| 2 表达EGFP的重组火鸡疱疹病毒rHVT-US2-EGFP的拯救与鉴定 | 第20-45页 |
| 2.1 材料 | 第20-22页 |
| 2.1.1 病毒与质粒 | 第20页 |
| 2.1.2 细胞与鸡胚 | 第20页 |
| 2.1.3 主要试剂与试剂盒 | 第20-21页 |
| 2.1.4 主要实验仪器 | 第21-22页 |
| 2.2 方法 | 第22-38页 |
| 2.2.1 设计引物 | 第22-23页 |
| 2.2.2 px330-gRNA质粒的构建 | 第23-26页 |
| 2.2.2.1 gRNA双链退火 | 第23页 |
| 2.2.2.2 px330质粒的BbsⅠ单一酶切 | 第23-24页 |
| 2.2.2.3 酶切产物与双链退火引物快速链接 | 第24页 |
| 2.2.2.4 转化与菌液鉴定 | 第24-25页 |
| 2.2.2.5 阳性质粒的大量抽提 | 第25-26页 |
| 2.2.3 重组质粒pUC19-US2A-EGFP-US2B的构建 | 第26-34页 |
| 2.2.3.1 含US2基因左右臂的重组质粒的构建 | 第26页 |
| 2.2.3.2 鸡胚成纤维细胞(CEF)制备步骤 | 第26-27页 |
| 2.2.3.3 火鸡疱疹病毒细胞毒的冻存与复苏 | 第27-28页 |
| 2.2.3.4 火鸡疱疹病毒的增殖 | 第28页 |
| 2.2.3.5 火鸡疱疹病毒的DNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.3.6 US2基因左右臂的扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.3.7 目的片段的纯化 | 第29-30页 |
| 2.2.3.8 目的片段与pSIMPLE19EcoRV/BAPVector载体的连接 | 第30页 |
| 2.2.3.9 连接产物的转化及鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.3.10 阳性质粒小量提取及测序 | 第31-32页 |
| 2.2.3.11 US2基因左右同源臂的扩增 | 第32页 |
| 2.2.3.12 pUC19-EGFP表达载体质粒的线性化 | 第32页 |
| 2.2.3.13 pUC19-EGFP质粒双酶切产物的纯化 | 第32-33页 |
| 2.2.3.14 载体与目的片段进行同源重组 | 第33页 |
| 2.2.3.15 转化及重组质粒的PCR鉴定 | 第33页 |
| 2.2.3.16 线性化同源重组臂 | 第33-34页 |
| 2.2.4 共转染 | 第34-38页 |
| 2.2.4.1 次代鸡胚成纤维细胞中脂质体法转染 | 第34-35页 |
| 2.2.4.2 人肾上皮细胞中脂质体法转染 | 第35-36页 |
| 2.2.4.3 电转染法 | 第36页 |
| 2.2.4.4 转染条件的优化 | 第36-37页 |
| 2.2.4.5 重组病毒rHVT-US2-EGFP的筛选 | 第37-38页 |
| 2.2.4.6 US2重组病毒的鉴定 | 第38页 |
| 2.3 结果 | 第38-45页 |
| 2.3.1 px330质粒BbsⅠ酶切电泳结果 | 第38-39页 |
| 2.3.2 px330-gRNA菌液鉴定结果 | 第39页 |
| 2.3.3 US2左右臂菌液鉴定结果 | 第39-40页 |
| 2.3.4 pUC19-EGFP质粒双酶切实验结果 | 第40-41页 |
| 2.3.5 US2基因的左右同源臂扩增电泳结果 | 第41页 |
| 2.3.6 线性化重组质粒pUC19-US2A-EGFP-US2B的PCR扩增电泳结果 | 第41-42页 |
| 2.3.7 电压的优化 | 第42页 |
| 2.3.8 细胞量的优化实验结果 | 第42-43页 |
| 2.3.9 质粒转染量的优化实验结果 | 第43页 |
| 2.3.10 US2重组病毒的拯救及蚀斑纯化结果 | 第43页 |
| 2.3.11 US2重组病毒的鉴定结果 | 第43-45页 |
| 3 表达EGFP的两株重组火鸡疱疹病毒rHVT-US10-EGFP的拯救与鉴定 | 第45-55页 |
| 3.1 材料 | 第45页 |
| 3.2 方法 | 第45-55页 |
| 3.2.1 设计引物 | 第45-46页 |
| 3.2.2 px330-gRNA质粒的构建 | 第46-48页 |
| 3.2.2.1 gRNA双链退火 | 第46页 |
| 3.2.2.2 px330质粒的BbsⅠ单一酶切 | 第46页 |
| 3.2.2.3 酶切产物与双链退火引物快速连接 | 第46-47页 |
| 3.2.2.4 转化与菌液鉴定 | 第47页 |
| 3.2.2.5 阳性质粒的大量抽提 | 第47-48页 |
| 3.2.3 重组质粒pUC19-US10A-EGFP-US10B的构建 | 第48-50页 |
| 3.2.3.1 US10基因左右臂的扩增 | 第48页 |
| 3.2.3.2 US10基因左右同源臂的扩增 | 第48页 |
| 3.2.3.3 载体与目的片段进行同源重组 | 第48-49页 |
| 3.2.3.4 转化及重组质粒的PCR鉴定 | 第49页 |
| 3.2.3.5 线性化同源重组臂 | 第49-50页 |
| 3.2.4 电转染 | 第50页 |
| 3.2.5 重组病毒rHVT-US10-EGFP的筛选 | 第50页 |
| 3.2.6 US10重组病毒的鉴定 | 第50-51页 |
| 3.2.7 结果 | 第51-55页 |
| 3.2.7.1 px330-gRNA菌液鉴定结果 | 第51页 |
| 3.2.7.2 US10左右同源臂菌液鉴定结果 | 第51-52页 |
| 3.2.7.3 US10左右同源臂扩增电泳图结果 | 第52-53页 |
| 3.2.7.4 线性化重组质粒pUC19-US10A-EGFP-US10B的PCR扩增电泳结果 | 第53页 |
| 3.2.7.5 US10重组病毒的拯救与蚀斑纯化结果 | 第53-54页 |
| 3.2.7.6 US10重组病毒的鉴定结果 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-58页 |
| 5 结论 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 作者简介 | 第65页 |
