| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 1 前言 | 第15-28页 |
| 1.1 研究的目的和意义 | 第15-16页 |
| 1.2 产气荚膜梭菌免疫防治相关研究进展 | 第16-23页 |
| 1.2.1 产气荚膜梭菌概述 | 第16页 |
| 1.2.2 产气荚膜梭菌α毒素的研究进展 | 第16-22页 |
| 1.2.3 α毒素疫苗的研究进展 | 第22-23页 |
| 1.3 乳酸菌作为疫苗载体的研究进展 | 第23-26页 |
| 1.3.1 乳酸菌作为疫苗传递系统的优势 | 第23-24页 |
| 1.3.2 乳酸菌与粘膜免疫系统 | 第24-26页 |
| 1.4 乳酸菌基因打靶操作系统研究进展 | 第26-28页 |
| 2 材料与方法 | 第28-43页 |
| 2.1 材料 | 第28-29页 |
| 2.1.1 载体质粒与菌株 | 第28页 |
| 2.1.2 主要化学试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第29页 |
| 2.2 试骑方法 | 第29-43页 |
| 2.2.1 HCE启动子的克隆与活性验证 | 第29-33页 |
| 2.2.2 表达盒(PPαT)的构建 | 第33-34页 |
| 2.2.3 表达盒PPαT表达的验证 | 第34-35页 |
| 2.2.4 pGBHCupp-2A2B-PPαT重组质粒的构建 | 第35-36页 |
| 2.2.5 乳酸菌感受态细胞的制备及转化 | 第36-37页 |
| 2.2.6 含PPαT表达盒转基因干酪乳杆菌的筛选 | 第37-38页 |
| 2.2.7 重组干酪乳杆菌PPαTΔupp L.casei ATCC 393特性分析 | 第38页 |
| 2.2.8 PPαTΔupp L.casei ATCC 393表达 | 第38-39页 |
| 2.2.9 口服PPαTΔupp L.casei ATCC免疫学指标的测定 | 第39-41页 |
| 2.2.10 免疫鼠攻产气荚膜梭菌α毒素保护性试验 | 第41-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-67页 |
| 3.1 启动子HCE的克隆与鉴定结果 | 第43-44页 |
| 3.1.1 启动子HCE PCR扩增结果 | 第43页 |
| 3.1.2 启动子HCE酶切与PCR鉴定结果 | 第43-44页 |
| 3.2 启动子HCE表达验证 | 第44-45页 |
| 3.2.1 pHCE612-SLS质粒鉴定结果 | 第44-45页 |
| 3.2.2 pHHCE612-SLS在干酪乳杆菌中的表达 | 第45页 |
| 3.3 α毒素基因的克隆与鉴定结果 | 第45-46页 |
| 3.4 PPαT表达盒的构建结果 | 第46-47页 |
| 3.5 表达盒在pPG612载体中的表达验证 | 第47页 |
| 3.6 pGBHCupp-2A2B-PPαT重组质粒的获得 | 第47-51页 |
| 3.6.1 pGBHCupp-2A2B-PPαT/TG1质粒酶切鉴定结果 | 第47-48页 |
| 3.6.2 pGBHCupp-2A2B-PPαT/L.casei质粒鉴定结果 | 第48-49页 |
| 3.6.3 pGBHCupp-2A2B-PPαT重组质粒构建策略 | 第49-51页 |
| 3.7 pGBHCupp-2A2B-PPαT质粒与L.casei重组鉴定结果 | 第51-52页 |
| 3.7.1 PCR鉴定结果 | 第51页 |
| 3.7.2 基因组PCR测序结果 | 第51-52页 |
| 3.8 PPαTΔupp L.casei重组菌特性研究 | 第52-55页 |
| 3.8.1 PPαTΔupp L.casei形态学特性分析 | 第52页 |
| 3.8.2 PPαTΔupp L.casei遗传稳定性分析 | 第52-53页 |
| 3.8.3 PPαTΔupp L.casei生长特性分析 | 第53-54页 |
| 3.8.4 5-FU抗性研究 | 第54-55页 |
| 3.9 PPαTΔupp L.casei基因组表达结果 | 第55-56页 |
| 3.9.1 Western blotting结果 | 第55-56页 |
| 3.9.2 间接ELISA结果 | 第56页 |
| 3.9.3 激光共聚焦结果 | 第56页 |
| 3.10 口服PPαTΔupp L.casei ATCC免疫学指标的测定 | 第56-64页 |
| 3.10.1 免疫小鼠特异性抗体IgA测定 | 第56-59页 |
| 3.10.2 免疫小鼠血清中特异性抗体IgG测定 | 第59-60页 |
| 3.10.3 脾淋巴细胞增殖实验 | 第60-61页 |
| 3.10.4 CD4细胞亚类及细胞因子的检测 | 第61-64页 |
| 3.11 免疫小鼠攻毒保护性试验结果 | 第64-67页 |
| 3.11.1 天然α毒素致病性试验结果 | 第64-65页 |
| 3.11.2 最小致死量(MLD)测定结果 | 第65页 |
| 3.11.3 攻毒试验结果 | 第65页 |
| 3.11.4 免疫小鼠血清对产气荚膜梭菌α毒素的中和效力试验结果 | 第65-67页 |
| 4 讨论 | 第67-71页 |
| 4.1 重组产气荚膜梭菌α毒素的去毒性 | 第67页 |
| 4.2 构建的表达盒元件 | 第67-68页 |
| 4.3 温敏型质粒和L.casei ATCC 393的同源重组 | 第68-69页 |
| 4.4 重组菌的表达情况 | 第69页 |
| 4.5 口服重组干酪乳杆菌粘膜免疫效果分析 | 第69-71页 |
| 5 结论 | 第71-73页 |
| 致谢 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-85页 |
| 附录 | 第85-99页 |
| 附录A 序列对比结果 | 第85-93页 |
| 附录B 英文縮略词表 | 第93-94页 |
| 附录C：培养基的配制 | 第94-95页 |
| 附录D：主要试剂的配制 | 第95-99页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第99页 |
