| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11页 |
| 绪论 | 第13-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-50页 |
| 1.1 引言 | 第15页 |
| 1.2 基因工程药物 | 第15-19页 |
| 1.2.1 基因工程药物的研制 | 第16页 |
| 1.2.2 基因工程药物的发展 | 第16-17页 |
| 1.2.3 基因工程药物的现状 | 第17-19页 |
| 1.3 基因重组蛋白质在E. coli和其它细胞中的表达 | 第19-20页 |
| 1.4 基因重组蛋白质包涵体的体外重折叠复性 | 第20-35页 |
| 1.4.1 包涵体的性质 | 第20-21页 |
| 1.4.2 包涵体的形成 | 第21-22页 |
| 1.4.3 包涵体的分离和溶解 | 第22-24页 |
| 1.4.3.1 包涵体的分离 | 第22页 |
| 1.4.3.2 包涵体的溶解 | 第22-24页 |
| 1.4.4 蛋白质的复性机理 | 第24-25页 |
| 1.4.4.1 蛋白质的变性作用 | 第24页 |
| 1.4.4.2 蛋白质体外折叠复性的机理与过程 | 第24-25页 |
| 1.4.5 包涵体蛋白质体外折叠复性方法 | 第25-35页 |
| 1.4.5.1 稀释和透析复性 | 第25-26页 |
| 1.4.5.2 添加促进剂协助复性 | 第26-28页 |
| 1.4.5.3 分子伴侣协助蛋白质复性 | 第28-32页 |
| 1.4.5.4 层析复性 | 第32-35页 |
| 1.5 人干扰素-γ | 第35-41页 |
| 1.5.1 干扰素的分类 | 第36页 |
| 1.5.2 IFN-γ的理化性质和生物学作用 | 第36-37页 |
| 1.5.2.1 IFN-γ的理化性质 | 第36页 |
| 1.5.2.2 IFN-γ的生物学作用 | 第36-37页 |
| 1.5.3 IFN-γ的分子生物学 | 第37-38页 |
| 1.5.3.1 IFN-γ的基因 | 第37页 |
| 1.5.3.2 IFN-γ的受体和诱导因子 | 第37-38页 |
| 1.5.3.3 IFN-γ的作用机制 | 第38页 |
| 1.5.4 IFN-γ的分子结构和空间构象 | 第38-40页 |
| 1.5.4.1 IFN-γ的分子结构 | 第38-39页 |
| 1.5.4.2 IFN-γ的空间构象 | 第39-40页 |
| 1.5.5 IFN-γ的生产方法 | 第40页 |
| 1.5.6 复性后重组人IFN-γ的检测方法 | 第40-41页 |
| 1.6 研究思路 | 第41-43页 |
| 参考文献 | 第43-50页 |
| 第二章 重组人干扰素-γ基因工程菌的发酵 | 第50-63页 |
| 2.1 引言 | 第50-51页 |
| 2.2 实验材料和仪器 | 第51-52页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第51页 |
| 2.2.1.1 菌种 | 第51页 |
| 2.2.1.2 培养基 | 第51页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第51-52页 |
| 2.3 实验方法 | 第52-53页 |
| 2.3.1 菌种活化 | 第52页 |
| 2.3.2 种子培养 | 第52页 |
| 2.3.3 发酵培养 | 第52页 |
| 2.3.4 培养和诱导时间 | 第52页 |
| 2.3.5 培养基组成的影响 | 第52-53页 |
| 2.3.6 发酵条件的影响 | 第53页 |
| 2.4 分析方法 | 第53-54页 |
| 2.4.1 菌体浓度测定 | 第53页 |
| 2.4.2 人干扰素-γ表达量测定 | 第53-54页 |
| 2.5 实验结果与讨论 | 第54-61页 |
| 2.5.1 人干扰素-γ基因工程菌的生长 | 第54页 |
| 2.5.2 人干扰素-γ的表达情况 | 第54-55页 |
| 2.5.3 不同培养、诱导时间对菌体生长和重组人干扰素-γ表达的影响 | 第55-57页 |
| 2.5.4 葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物对工程菌生长和重组人干扰素-γ表达水平的影响 | 第57-59页 |
| 2.5.5 发酵条件对工程菌生长和重组人干扰素-γ表达水平的影响 | 第59-61页 |
| 2.6 本章小结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-63页 |
| 第三章 重组人干扰素-γ包涵体的制备、洗涤溶解及稀释复性研究 | 第63-79页 |
| 3.1 引言 | 第63-64页 |
| 3.2 实验材料和仪器 | 第64-65页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第64-65页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第65页 |
| 3.3 实验方法 | 第65-66页 |
| 3.3.1 包涵体的制备 | 第65-66页 |
| 3.3.2 包涵体的洗涤 | 第66页 |
| 3.3.3 包涵体的溶解 | 第66页 |
| 3.3.4 包涵体溶解蛋白的稀释复性 | 第66页 |
| 3.4 分析方法 | 第66-69页 |
| 3.4.1 包涵体纯度测定 | 第66-67页 |
| 3.4.2 蛋白浓度测定 | 第67页 |
| 3.4.3 重组人干扰素-γ活性测定 | 第67-69页 |
| 3.5 实验结果与讨论 | 第69-75页 |
| 3.5.1 细胞破碎与包涵体制备 | 第69页 |
| 3.5.2 重组人干扰素-γ包涵体的洗涤和溶解 | 第69-71页 |
| 3.5.3 重组人干扰素-γ包涵体的稀释复性研究 | 第71-75页 |
| 3.5.3.1 重组人干扰素-γ包涵体变性蛋白浓度对复性的影响 | 第71-72页 |
| 3.5.3.2 尿素浓度对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第72页 |
| 3.5.3.3 温度对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第72-73页 |
| 3.5.3.4 pH对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第73-74页 |
| 3.5.3.5 NaCl浓度对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第74-75页 |
| 3.5.3.6 脉冲加样对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第75页 |
| 3.6 本章小结 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-79页 |
| 第四章 重组人干扰素-γ包涵体的离子交换层析复性研究 | 第79-98页 |
| 4.1 引言 | 第79-81页 |
| 4.2 实验材料和仪器 | 第81-82页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第81页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第81-82页 |
| 4.3 实验方法 | 第82-83页 |
| 4.3.1 重组人干扰素-γ包涵体溶解蛋白的制备 | 第82页 |
| 4.3.2 离子交换层析复性包涵体溶解蛋白 | 第82-83页 |
| 4.3.3 体积排阻层析分析复性蛋白样品 | 第83页 |
| 4.4 分析方法 | 第83-84页 |
| 4.4.1 蛋白浓度测定 | 第83-84页 |
| 4.4.2 SDS-PAGE | 第84页 |
| 4.4.3 重组人干扰素-γ活性测定 | 第84页 |
| 4.5 实验结果与讨论 | 第84-94页 |
| 4.5.1 SP离子交换柱对重组人干扰素-γ的吸附作用 | 第84-85页 |
| 4.5.2 尿素梯度离子交换层析复性重组人干扰素-γ | 第85-87页 |
| 4.5.3 上样量对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第87-89页 |
| 4.5.4 流速对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第89-90页 |
| 4.5.5 尿素梯度长度对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第90-92页 |
| 4.5.6 尿素终浓度对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第92-93页 |
| 4.5.7 体积排阻层析对离子交换层析复性样品的分析 | 第93-94页 |
| 4.6 本章小结 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-98页 |
| 第五章 重组人干扰素-γ包涵体的扩张床吸附层析复性研究 | 第98-119页 |
| 5.1 引言 | 第98-100页 |
| 5.2 实验材料和仪器 | 第100-101页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第100页 |
| 5.2.2 实验仪器 | 第100-101页 |
| 5.3 实验方法 | 第101-102页 |
| 5.3.1 重组人干扰素-γ包涵体变性液的制备 | 第101页 |
| 5.3.2 重组人干扰素-γ基因工程菌细胞溶解液的制备 | 第101页 |
| 5.3.3 扩张床吸附层析复性包涵体变性液 | 第101-102页 |
| 5.4 分析方法 | 第102-103页 |
| 5.4.1 rhIFN-γ蛋白浓度测定 | 第102-103页 |
| 5.4.2 SDS-PAGE电泳 | 第103页 |
| 5.4.3 rhIFN-γ活性测定 | 第103页 |
| 5.5 实验结果与讨论 | 第103-116页 |
| 5.5.1 扩张床对rhIFN-γ基因工程菌细胞溶解液和包涵体变性液的吸附作用 | 第103-106页 |
| 5.5.2 PBS缓冲液浓度的选择 | 第106-107页 |
| 5.5.3 不同尿素浓度下的线性流速对膨胀率的影响 | 第107-108页 |
| 5.5.4 尿素梯度扩张床吸附层析复性重组人干扰素-γ | 第108-110页 |
| 5.5.5 膨胀率对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第110-111页 |
| 5.5.6 尿素梯度长度对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第111-113页 |
| 5.5.7 尿素终浓度对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第113-114页 |
| 5.5.8 上样量对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第114-116页 |
| 5.6 本章小结 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-119页 |
| 第六章 小分子伴侣sht GroEL191-345协助重组人干扰素-γ包涵体复性的研究 | 第119-135页 |
| 6.1 引言 | 第119-120页 |
| 6.2 实验材料和仪器 | 第120-121页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第120-121页 |
| 6.2.1.1 质粒与宿主菌 | 第120-121页 |
| 6.2.1.2 培养基 | 第121页 |
| 6.2.1.3 实验材料 | 第121页 |
| 6.2.2 实验仪器 | 第121页 |
| 6.3 实验方法 | 第121-124页 |
| 6.3.1 小分子伴侣的发酵制备 | 第121-122页 |
| 6.3.1.1 菌种活化 | 第121-122页 |
| 6.3.1.2 种子培养 | 第122页 |
| 6.3.1.3 发酵培养 | 第122页 |
| 6.3.1.4 细胞收集和破碎 | 第122页 |
| 6.3.2 小分子伴侣的分离纯化 | 第122-123页 |
| 6.3.2.1 Ni-NTA亲和层析 | 第122-123页 |
| 6.3.2.2 脱盐及浓缩 | 第123页 |
| 6.3.3 重组人干扰素-γ包涵体的制备、洗涤和溶解 | 第123页 |
| 6.3.4 游离小分子伴侣协助rhIFN-γ复性 | 第123-124页 |
| 6.3.4.1 复性温度和时间对rhIFN-γ复性的影响 | 第123页 |
| 6.3.4.2 小分子伴侣sht GroEL191-345协助复性与稀释复性效果的比较 | 第123-124页 |
| 6.3.5 固定化小分子伴侣协助rhIFN-γ复性 | 第124页 |
| 6.3.5.1 小分子伴侣GroEL191-345的固定化 | 第124页 |
| 6.3.5.2 固定化小分子伴侣GroEL191-345的分批复性 | 第124页 |
| 6.4 分析方法 | 第124-125页 |
| 6.4.1 菌体浓度测定 | 第124页 |
| 6.4.2 葡萄糖浓度的测定 | 第124-125页 |
| 6.4.3 蛋白浓度测定 | 第125页 |
| 6.4.4 SDS-PAGE电泳 | 第125页 |
| 6.4.5 重组人干扰素-γ活性测定 | 第125页 |
| 6.5 实验结果与讨论 | 第125-133页 |
| 6.5.1 小分子伴侣sht GroEL191-345在发酵罐中的表达 | 第125-126页 |
| 6.5.2 小分子伴侣sht GroEL191-345的分离纯化 | 第126-129页 |
| 6.5.3 游离小分子伴侣对rhIFN-γ复性的影响 | 第129-131页 |
| 6.5.3.1 复性温度和时间对小分子伴侣协助rhIFN-γ复性的影响 | 第129-130页 |
| 6.5.3.2 小分子伴侣sht GroEL191-345协助复性与稀释复性效果的比较 | 第130-131页 |
| 6.5.4 固定化小分子伴侣对重组人干扰素-γ复性的影响 | 第131-132页 |
| 6.5.5 固定化小分子伴侣sht GroEL191-345的重复使用 | 第132-133页 |
| 6.6 本章小结 | 第133-134页 |
| 参考文献 | 第134-135页 |
| 第七章 重折叠人干扰素-γ的结构表征和复性方法的比较 | 第135-143页 |
| 7.1 引言 | 第135-136页 |
| 7.2 实验仪器 | 第136页 |
| 7.3 实验方法 | 第136页 |
| 7.4 实验结果与讨论 | 第136-141页 |
| 7.4.1 重折叠人干扰素-γ的结构特性分析 | 第136-138页 |
| 7.4.2 复性方法的比较 | 第138-141页 |
| 7.4.2.1 复性机理的比较 | 第138-139页 |
| 7.4.2.2 复性效果的比较 | 第139-141页 |
| 7.5 本章小结 | 第141-142页 |
| 参考文献 | 第142-143页 |
| 第八章 结论与建议 | 第143-146页 |
| 8.1 结论 | 第143-144页 |
| 8.2 建议 | 第144-146页 |
| 致谢 | 第146-147页 |
| 作者简介 | 第147-148页 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 | 第148页 |
