| 中文摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 英语缩略词表 | 第14-15页 |
| 引言 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-29页 |
| 综述一 牛病毒性腹泻/粘膜病的研究进展 | 第16-23页 |
| 1 牛病毒性腹泻/粘膜病的概况 | 第16页 |
| 2 BVDV基因组特性 | 第16-20页 |
| 2.1 结构蛋白 | 第17-18页 |
| 2.1.1 核心蛋白C | 第17-18页 |
| 2.1.2 囊膜蛋白E~(rns) | 第18页 |
| 2.1.3 囊膜蛋白E1 | 第18页 |
| 2.1.4 囊膜蛋白E2 | 第18页 |
| 2.2 非结构蛋白 | 第18-20页 |
| 2.2.1 非结构蛋白N~(pro) | 第18-19页 |
| 2.2.2 非结构蛋白P7 | 第19页 |
| 2.2.3 非结构蛋白NS2 | 第19页 |
| 2.2.4 非结构蛋白NS3 | 第19页 |
| 2.2.5 非结构蛋白NS4A和NS4B | 第19页 |
| 2.2.6 非结构蛋白NS5A和NS5B | 第19-20页 |
| 3 BVDV的检测 | 第20-22页 |
| 3.1 检测抗原 | 第20-21页 |
| 3.1.1 病毒分离(VI) | 第20页 |
| 3.1.2 抗原捕获ELISA(ACE-ELISA) | 第20页 |
| 3.1.3 免疫组化(IHC) | 第20-21页 |
| 3.1.4 核酸检测 | 第21页 |
| 3.2 检测抗体 | 第21-22页 |
| 3.2.1 病毒中和实验(VN) | 第21页 |
| 3.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第21-22页 |
| 4 小结与展望 | 第22-23页 |
| 综述二 纳米抗体的研究进展及应用 | 第23-29页 |
| 1 纳米抗体的概述 | 第23页 |
| 2 纳米抗体的特性 | 第23-26页 |
| 2.1 纳米抗体结构特性 | 第23-25页 |
| 2.2 纳米抗体功能特性 | 第25-26页 |
| 2.2.1 高水溶性和稳定性 | 第25页 |
| 2.2.2 抗原识别能力强 | 第25-26页 |
| 2.2.3 免疫原性低 | 第26页 |
| 2.2.4 穿透性强 | 第26页 |
| 3 纳米抗体的应用 | 第26-29页 |
| 3.1 纳米抗体用于分子成像 | 第26-27页 |
| 3.2 纳米抗体诊断 | 第27页 |
| 3.3 纳米抗体靶向治疗 | 第27-28页 |
| 3.4 纳米抗体用于农业保护和食品分析 | 第28-29页 |
| 第二章 实验研究 | 第29-75页 |
| 实验一 BVDV重组E0蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立 | 第29-39页 |
| 1 材料与方法 | 第30-32页 |
| 1.1 材料 | 第30页 |
| 1.2 方法 | 第30-32页 |
| 1.2.1 BVDV-E0表达载体的构建 | 第30页 |
| 1.2.2 间接ELISA操作步骤 | 第30-31页 |
| 1.2.3 间接ELISA条件的优化 | 第31页 |
| 1.2.4 临界值的确定 | 第31-32页 |
| 1.2.5 特异性实验 | 第32页 |
| 1.2.6 敏感性实验 | 第32页 |
| 1.2.7 与商品化试剂盒的比较 | 第32页 |
| 2 结果 | 第32-37页 |
| 2.1 BVDV-E0蛋白表达载体的构建及表达 | 第32-33页 |
| 2.2 最佳反应条件的选择 | 第33-36页 |
| 2.2.1 抗原包被浓度和血清稀释比 | 第33-34页 |
| 2.2.2 最佳封闭液和封闭时间的确定 | 第34页 |
| 2.2.3 血清最佳孵育时间 | 第34-35页 |
| 2.2.4 酶标二抗稀释倍数及作用时间的确定 | 第35页 |
| 2.2.5 底物作用最佳时间 | 第35-36页 |
| 2.3 临界值的确定 | 第36页 |
| 2.4 特异性实验 | 第36页 |
| 2.5 敏感性实验 | 第36-37页 |
| 2.6 与商品化试剂盒的比较 | 第37页 |
| 3 讨论 | 第37-39页 |
| 实验二 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白纳米抗体文库的扩增及筛选 | 第39-48页 |
| 1 材料与方法 | 第40-44页 |
| 1.1 材料 | 第40页 |
| 1.1.1 菌株、抗体 | 第40页 |
| 1.1.2 试剂 | 第40页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第40页 |
| 1.2 方法 | 第40-44页 |
| 1.2.1 扩增与收集辅助噬菌体M13K07 | 第40页 |
| 1.2.2 辅助噬菌体M13K07的滴度测定 | 第40-41页 |
| 1.2.3 BVDV纳米抗体噬菌体展示文库的扩增 | 第41页 |
| 1.2.4 BVDV纳米抗体噬菌体展示文库滴度的测定 | 第41-42页 |
| 1.2.5 筛选抗BVDV-E0的纳米抗体 | 第42-43页 |
| 1.2.6 噬菌体VHH单克隆的制备 | 第43页 |
| 1.2.7 Phage ELISA验证 | 第43-44页 |
| 1.2.8 间接ELISA测定抗BVDV-E0纳米抗体的特异性 | 第44页 |
| 1.2.9 ELISA阳性纳米抗体噬菌体单克隆的序列测定 | 第44页 |
| 2 结果 | 第44-47页 |
| 2.1 辅助性噬菌体M13KO7滴度的测定 | 第44页 |
| 2.2 文库滴度的测定 | 第44-45页 |
| 2.3 BVDV特异性VHH纳米抗体的筛选 | 第45页 |
| 2.4 PHAGE ELISA初步验证 | 第45-46页 |
| 2.5 间接ELISA测定BVDV-E0纳米抗体的特异性 | 第46-47页 |
| 2.6 ELISA阳性纳米抗体噬菌体单克隆的序列测定 | 第47页 |
| 3 讨论 | 第47-48页 |
| 实验三 纳米抗体NB1和NB2原核表达载体的构建及大肠杆菌中诱导表达 | 第48-62页 |
| 1 材料与方法 | 第48-54页 |
| 1.1 材料 | 第48-49页 |
| 1.1.1 试剂 | 第48-49页 |
| 1.1.2 主要仪器 | 第49页 |
| 1.2 方法 | 第49-54页 |
| 1.2.1 Nb1和Nb2引物设计 | 第49页 |
| 1.2.2 目的基因扩增 | 第49-50页 |
| 1.2.3 目的片段PCR产物检测及胶回收 | 第50页 |
| 1.2.4 目的片段连接T载体 | 第50页 |
| 1.2.5 转化重组表达载体至DH5α感受态细胞 | 第50页 |
| 1.2.6 目的片段连接T载体重组质粒的鉴定 | 第50-51页 |
| 1.2.7 pET-30a(+)-Nb1/Nb2原核表达载体的构建及鉴定 | 第51-52页 |
| 1.2.8 pET-30a-Nb1/Nb2原核表达及蛋白的纯化 | 第52-54页 |
| 1.2.9 WB检测Nb1和Nb2蛋白 | 第54页 |
| 2 结果 | 第54-61页 |
| 2.1 纳米抗体NB1和NB2目的基因的扩增 | 第54-55页 |
| 2.2 重组表达载体PET-30A-NB1/NB2的构建 | 第55-56页 |
| 2.3 SDS-PAGE结果 | 第56-57页 |
| 2.4 NB1和NB2的纯化 | 第57-59页 |
| 2.4.1 上清中亲和层析纯化Nb1蛋白 | 第57-58页 |
| 2.4.2 上清中亲和层析纯化Nb2蛋白 | 第58-59页 |
| 2.5 WB检测NB1和NB2蛋白 | 第59-61页 |
| 3 讨论 | 第61-62页 |
| 实验四 BVDV-E0纳米抗体NB1和NB2生物特性的研究 | 第62-70页 |
| 1 材料和方法 | 第62-65页 |
| 1.1 材料 | 第62-63页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第62-63页 |
| 1.1.2 实验仪器 | 第63页 |
| 1.2 方法 | 第63-65页 |
| 1.2.1 纳米抗体结合力的验证 | 第63-64页 |
| 1.2.2 纳米抗体亲和力的鉴定 | 第64页 |
| 1.2.3 纳米抗体活性的分析 | 第64页 |
| 1.2.4 细胞水平验证纳米抗体毒性 | 第64-65页 |
| 2 结果 | 第65-68页 |
| 2.1 WB实验结果 | 第65-66页 |
| 2.2 纳米抗体亲和力 | 第66-67页 |
| 2.3 纳米抗体活性分析 | 第67页 |
| 2.4 细胞水平验证NB1和NB2的细胞毒性 | 第67-68页 |
| 3 讨论 | 第68-70页 |
| 实验五 基于纳米抗体NB1 ELISA检测方法的建立 | 第70-75页 |
| 1 材料与方法 | 第70-72页 |
| 1.1 材料 | 第70-71页 |
| 1.2 方法 | 第71-72页 |
| 1.2.1 重组蛋白E0制备 | 第71页 |
| 1.2.2 BVDV-NADL的扩增 | 第71页 |
| 1.2.3 兔多克隆抗体和羊驼多克隆抗体的制备 | 第71页 |
| 1.2.4 血清抗体效价的检测 | 第71页 |
| 1.2.5 双抗夹心ELISA | 第71-72页 |
| 1.2.6 间接阻断ELISA | 第72页 |
| 2 结果 | 第72-74页 |
| 2.1 多克隆抗体血清效价的检测 | 第72-73页 |
| 2.2 双抗夹心ELISA | 第73页 |
| 2.3 间接阻断ELISA | 第73-74页 |
| 3 讨论 | 第74-75页 |
| 第三章 实验结论 | 第75-76页 |
| 创新点 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 作者简介 | 第85-86页 |
| 附件 | 第86页 |
