| 本论文的创新性工作 | 第3-4页 |
| 中文摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一部分 文献综述及选题目的和意义 | 第13-23页 |
| 第一章 鸭乙型肝炎病毒基因组结构及其编码蛋白的研究进展 | 第13-23页 |
| 1. 鸭乙型肝炎病毒概述 | 第13页 |
| 2. 鸭乙型肝炎病毒基因组结构 | 第13-14页 |
| 3. DHBV病毒蛋白特性及功能 | 第14-21页 |
| 3.1 包膜蛋白结构及功能 | 第14-17页 |
| 3.1.1 包膜蛋白的基本形式及其特性 | 第14-16页 |
| 3.1.2 包膜蛋白独特的拓扑结构 | 第16页 |
| 3.1.3 包膜蛋白的功能 | 第16-17页 |
| 3.2 衣壳蛋白 | 第17-19页 |
| 3.2.1 衣壳蛋白的基本结构特性 | 第18页 |
| 3.2.2 衣壳蛋白的磷酸化调节功能 | 第18页 |
| 3.2.3 衣壳蛋白的组装基因组功能 | 第18页 |
| 3.2.4 衣壳蛋白的运输功能 | 第18-19页 |
| 3.3 多聚酶P蛋白 | 第19-20页 |
| 3.3.1 P蛋白的基本结构 | 第19页 |
| 3.3.2 多聚酶P蛋白功能 | 第19-20页 |
| 3.4 X样蛋白 | 第20-21页 |
| 3.4.1 X样蛋白蛋白的发现 | 第20页 |
| 3.4.2 DHBx的反式激活作用 | 第20-21页 |
| 3.4.3 DHBx不影响病毒蛋白的表达和DNA的合成 | 第21页 |
| 4. 展望 | 第21页 |
| 5. 选题目的及意义 | 第21-23页 |
| 第二部分 试验研究 | 第23-60页 |
| 第二章 DHBV PreC/C基因序列分析、克隆表达、蛋白纯化及多抗制备 | 第23-38页 |
| 1. 材料 | 第23-24页 |
| 1.1 实验毒株、细胞及载体 | 第23页 |
| 1.2 实验动物 | 第23页 |
| 1.3 主要试剂及工具酶 | 第23-24页 |
| 1.4 主要溶液配制 | 第24页 |
| 2. 方法 | 第24-27页 |
| 2.1 PreC/C基因及其编码蛋白的分子特性分析 | 第24页 |
| 2.2 衣壳蛋白基因PreC/C的扩增 | 第24-25页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第24-25页 |
| 2.2.2 病毒基因组提取及PreC/C基因扩增 | 第25页 |
| 2.3 PreC/C基因的克隆及测序 | 第25页 |
| 2.4 PreC/C基因表达载体的构建 | 第25页 |
| 2.5 DHBV衣壳蛋白的优化表达及纯化 | 第25-26页 |
| 2.6 重组衣壳蛋白的纯化 | 第26页 |
| 2.6.1 重组衣壳蛋白可溶性分析 | 第26页 |
| 2.6.2 衣壳蛋白包涵体纯化 | 第26页 |
| 2.7 兔抗DHBV衣壳蛋白多克隆抗体的制备 | 第26-27页 |
| 2.8 多克隆抗体IgG的纯化及鉴定 | 第27页 |
| 3. 结果 | 第27-36页 |
| 3.1 DHBV衣壳蛋白分子特性分析 | 第27-31页 |
| 3.1.1 DHBV CHv株PreC/C基因开放阅读框的寻找 | 第27页 |
| 3.1.2 PreC/C基因编码衣壳蛋白的组分分析 | 第27-28页 |
| 3.1.3 衣壳蛋白氨基酸序列BLAST分析 | 第28-29页 |
| 3.1.4 衣壳蛋白信号肽预测 | 第29页 |
| 3.1.5 衣壳蛋白蛋白疏水性分析 | 第29-30页 |
| 3.1.6 衣壳蛋白抗原性分析 | 第30页 |
| 3.1.7 衣壳蛋白跨膜预测 | 第30-31页 |
| 3.1.8 衣壳蛋白二级结构预测 | 第31页 |
| 3.2 PreC/C基因的扩增及克隆 | 第31-32页 |
| 3.3 PreC/C基因原核表达载体的构建及酶切鉴定 | 第32-33页 |
| 3.4 重组衣壳蛋白的表达及优化及纯化 | 第33-34页 |
| 3.4.1 诱导温度的优化 | 第33页 |
| 3.4.2 IPTG浓度优化 | 第33页 |
| 3.4.3 诱导时间的优化 | 第33页 |
| 3.4.4 衣壳蛋白的纯化 | 第33-34页 |
| 3.5 抗体效价的测定 | 第34-35页 |
| 3.6 抗体血清IgG纯化 | 第35-36页 |
| 4. 讨论 | 第36-38页 |
| 4.1 PreC/C基因分子特性的分析 | 第36页 |
| 4.2 PreC/C基因表达的意义及表达菌株、载体的选择 | 第36-37页 |
| 4.3 诱导条件的优化 | 第37页 |
| 4.4 多克隆抗体血清的制备 | 第37-38页 |
| 第三章 鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白间接ELISA方法的建立 | 第38-48页 |
| 1. 材料 | 第39页 |
| 1.1 主要试剂 | 第39页 |
| 1.2 主要材料 | 第39页 |
| 1.3 主要溶液配制 | 第39页 |
| 1.4 主要仪器耗材 | 第39页 |
| 2. 试验方法 | 第39-41页 |
| 2.1 DHBV衣壳蛋白间接ELISA方法的建立 | 第39-41页 |
| 2.1.1 抗原包被量的优化选择 | 第39-40页 |
| 2.1.2 最佳抗原包被时间的选择 | 第40页 |
| 2.1.3 最佳封闭时间的选择 | 第40页 |
| 2.1.4 酶标二抗最佳工作浓度的选择 | 第40页 |
| 2.1.5 间接ELISA方法的建立 | 第40-41页 |
| 2.2 ELISA临界值的确定 | 第41页 |
| 2.3 间接ELISA方法的评估 | 第41页 |
| 2.3.1 间接ELISA敏感性试验 | 第41页 |
| 2.3.2 间接ELISA特异性试验 | 第41页 |
| 2.3.3 间接ELISA重复性试验 | 第41页 |
| 2.3.4 间接ELISA的可靠性分析 | 第41页 |
| 3. 结果 | 第41-46页 |
| 3.1 棋盘滴定法确定抗原最佳包被量 | 第41-42页 |
| 3.2 ELISA方法的优化 | 第42-44页 |
| 3.2.1 抗原最佳包被条件 | 第42-43页 |
| 3.2.2 最佳封闭条件的选择 | 第43页 |
| 3.2.3 酶标二抗的优化 | 第43-44页 |
| 3.3 间接ELISA方法的建立 | 第44页 |
| 3.4 临界值的计算 | 第44页 |
| 3.5 间接ELISA方法的评估 | 第44-46页 |
| 3.5.1 间接ELSA敏感性 | 第44-45页 |
| 3.5.2 间接ELISA特异性分析 | 第45页 |
| 3.5.3 间接ELISA重复性评估 | 第45-46页 |
| 3.5.4 间接ELISA方法可靠性评估 | 第46页 |
| 4. 讨论 | 第46-48页 |
| 第四章 PreC/C基因转录时相及表达时相的研究 | 第48-60页 |
| 1. 材料 | 第49-50页 |
| 1.1 毒株、细胞及抗体 | 第49页 |
| 1.2 主要试剂及药品 | 第49页 |
| 1.3 主要溶液的配置 | 第49-50页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第50页 |
| 2. 试验方法 | 第50-54页 |
| 2.1 PreC/C基因转录时相的研究 | 第50-53页 |
| 2.1.1 鸭原代肝细胞的分离培养 | 第50页 |
| 2.1.2 DHBV感染鸭原代细胞 | 第50-51页 |
| 2.1.3 细胞总RNA抽提及反转录 | 第51-52页 |
| 2.1.4 实时荧光定量PCR的建立 | 第52-53页 |
| 2.1.5 PreC/C基因转录的相对定量检测 | 第53页 |
| 2.2 PreC/C基因表达时相的研究 | 第53-54页 |
| 2.2.1 间接免疫荧光检测衣壳蛋白表达 | 第53页 |
| 2.2.2 Western Blotting检测衣壳蛋白表达 | 第53-54页 |
| 3. 试验结果 | 第54-58页 |
| 3.1 鸭原代肝细胞的分离培养 | 第54页 |
| 3.2 总RNA完整性的检测 | 第54-55页 |
| 3.3 荧光定量PCR方法建立 | 第55页 |
| 3.4 PreC/C基因转录时相定量分析 | 第55-56页 |
| 3.5 DHBV衣壳蛋白间接免疫荧光 | 第56-57页 |
| 3.6 Western Blotting | 第57-58页 |
| 4. 讨论 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 作者简介 | 第65-66页 |
| 基本情况 | 第65页 |
| 学习经历 | 第65页 |
| 攻读硕士期间发表论文 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
