| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-21页 |
| ·脂肪酶的应用研究 | 第12-14页 |
| ·脂肪酶在食品工业中的应用 | 第12-13页 |
| ·脂肪酶在纺织工业中的应用 | 第13页 |
| ·脂肪酶在洗涤剂工业中的应用 | 第13页 |
| ·脂肪酶在手性化合物合成中的应用 | 第13页 |
| ·脂肪酶在废物废水处理中的应用 | 第13-14页 |
| ·脂肪酶在造纸工业中的应用 | 第14页 |
| ·全基因合成技术简介 | 第14-17页 |
| ·基因合成发展历程 | 第14-15页 |
| ·基于PCR的基因合成法的原理 | 第15-16页 |
| ·全基因合成策略与原则 | 第16-17页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第17-18页 |
| ·毕赤酵母表达的优势 | 第17页 |
| ·常见的表达菌株 | 第17页 |
| ·毕赤酵母基因工程的载体系统 | 第17-18页 |
| ·T型载体 | 第18-20页 |
| ·TA克隆技术和T载体构建原理 | 第18-19页 |
| ·表达型T载体 | 第19-20页 |
| ·本课题的目的和意义 | 第20-21页 |
| 第二章 全基因合成方法的探索 | 第21-39页 |
| ·材料 | 第21-22页 |
| ·菌种和载体 | 第21页 |
| ·工具酶及试剂 | 第21页 |
| ·试剂盒 | 第21页 |
| ·培养基以及溶液配制 | 第21-22页 |
| ·常用仪器 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-28页 |
| ·拟合成基因序列的整理 | 第22-23页 |
| ·序列拆分方案 | 第23页 |
| ·单链寡核苷酸合成及溶解 | 第23页 |
| ·DA-PCR | 第23-24页 |
| ·OE-PCR | 第24页 |
| ·双酶消化目的基因与BSK载体 | 第24-25页 |
| ·T4 DNA连接酶连接 | 第25页 |
| ·转化大肠杆菌DH5α | 第25-26页 |
| ·筛选阳性克隆 | 第26页 |
| ·合成基因测序 | 第26-27页 |
| ·合成基因中错误碱基的修复 | 第27-28页 |
| ·结果与分析 | 第28-35页 |
| ·LQ5 基因序列拆分 | 第28-30页 |
| ·LQ5 基因合成方案 | 第30-31页 |
| ·DA-PCR的条件优化 | 第31页 |
| ·OE-PCR | 第31-32页 |
| ·酶切LQ5 基因与BSK载体 | 第32页 |
| ·酶连反应与转化DH5α细胞 | 第32页 |
| ·筛选阳性克隆 | 第32-33页 |
| ·LQ5 基因测序 | 第33页 |
| ·覆盖修复法修复错误碱基 | 第33-34页 |
| ·验证IOEP法 | 第34-35页 |
| ·讨论与小结 | 第35-39页 |
| 第三章 pAOX-HT载体构建 | 第39-51页 |
| ·材料 | 第39页 |
| ·菌种和载体 | 第39页 |
| ·工具酶及试剂 | 第39页 |
| ·试剂盒 | 第39页 |
| ·培养基以及溶液配制 | 第39页 |
| ·常用仪器 | 第39页 |
| ·方法 | 第39-45页 |
| ·突变pPIC9K载体的XcmI位点 | 第39-42页 |
| ·制备插入片段和构建pAOX-HT-GFP质粒 | 第42-43页 |
| ·制备pAOX-HT载体 | 第43-44页 |
| ·pAOX-HT载体克隆验证 | 第44-45页 |
| ·结果与分析 | 第45-50页 |
| ·Mu-X-1,2 的PCR扩增和Mu-X片段的拼接 | 第45页 |
| ·pPIC9K质粒载体和Mu-X片段的酶切与连接 | 第45-46页 |
| ·突变前后pPIC9K质粒的酶切比较 | 第46-47页 |
| ·PCR扩增插入片段XG | 第47页 |
| ·XG片段和pPIC9K（Mu-XcmI）质粒的酶切与连接 | 第47页 |
| ·转化DH5α并筛选阳性克隆子 | 第47-48页 |
| ·制备pAOX-HT载体 | 第48页 |
| ·pAOX-HT载体的克隆验证 | 第48-50页 |
| ·讨论与小结 | 第50-51页 |
| 第四章 pAOX-HT载体改进及表达验证 | 第51-65页 |
| ·材料 | 第51-53页 |
| ·菌种和载体 | 第51页 |
| ·工具酶及试剂 | 第51页 |
| ·试剂盒 | 第51页 |
| ·培养基以及溶液配制 | 第51-53页 |
| ·常用仪器 | 第53页 |
| ·方法 | 第53-58页 |
| ·pAOX-HT_(BSK)载体构建 | 第53-54页 |
| ·pAOX-HT_(BSK)载体正向连接方案 | 第54-55页 |
| ·pAOX-HT-calb的表达与纯化 | 第55-58页 |
| ·结果与分析 | 第58-63页 |
| ·PCR扩增BSK-A片段并与pAOX-HT载体连接 | 第58页 |
| ·制备pAOX-HTBSK载体 | 第58-59页 |
| ·扩增calb-Af基因片段并与pAOX-HTBSK载体连接 | 第59页 |
| ·转化反应与蓝斑统计 | 第59-60页 |
| ·DH5α-pAOX-HTBSK-calb-Af菌落PCR验证 | 第60-61页 |
| ·SalI与AflII的双酶切验证 | 第61-62页 |
| ·pAOX-HT载体的表达验证 | 第62-63页 |
| ·讨论和小结 | 第63-65页 |
| 第五章 yl2 基因的合成和表达 | 第65-72页 |
| ·材料 | 第65页 |
| ·方法 | 第65-66页 |
| ·yl2 基因的序列拆分 | 第65页 |
| ·寡核苷酸化学合成和yl2 全基因合成 | 第65页 |
| ·yl2 基因与pAOX-HTBSK载体的连接反应 | 第65页 |
| ·转化DH5α细胞和筛选阳性克隆 | 第65页 |
| ·yl2 基因测序与修复 | 第65页 |
| ·YL2 蛋白表达与纯化 | 第65-66页 |
| ·结果和分析 | 第66-71页 |
| ·yl2 基因序列拆分 | 第66-68页 |
| ·yl2 基因合成 | 第68页 |
| ·菌落PCR筛选正连阳性克隆 | 第68-69页 |
| ·基因测序与修复 | 第69页 |
| ·YL2 重组蛋白表达 | 第69页 |
| ·YL2 重组蛋白的纯化 | 第69-71页 |
| ·讨论与小结 | 第71-72页 |
| 结论与展望 | 第72-75页 |
| 参考文献 | 第75-80页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 附件 | 第82页 |
