| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第8-15页 |
| 1.1 L-精氨酸及其生产 | 第8-11页 |
| 1.1.1 L-精氨酸的理化性质 | 第8页 |
| 1.1.2 L-精氨酸的功能及应用 | 第8页 |
| 1.1.3 L-精氨酸的生产方法 | 第8-9页 |
| 1.1.4 L-精氨酸生产菌株的改造 | 第9页 |
| 1.1.5 L-精氨酸的合成途径 | 第9-11页 |
| 1.2 精氨酸合成限速酶N-乙酰谷氨酸激酶的研究进展 | 第11-13页 |
| 1.2.1 N-乙酰谷氨酸激酶受精氨酸反馈抑制的研究进展 | 第12页 |
| 1.2.2 N-乙酰谷氨酸激酶催化机理的研究进展 | 第12-13页 |
| 1.3 立题依据与研究意义 | 第13-14页 |
| 1.4 本论文的主要研究内容 | 第14-15页 |
| 第二章 材料与方法 | 第15-22页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第15-18页 |
| 2.1.1 质粒、菌株及引物 | 第15-16页 |
| 2.1.2 主要试剂、相关培养基及培养条件 | 第16-17页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第17-18页 |
| 2.2 实验方法 | 第18-22页 |
| 2.2.1 染色体基因组DNA的提取与质粒DNA的提取 | 第18页 |
| 2.2.2 重叠延伸PCR技术及其产物的回收 | 第18页 |
| 2.2.3 突变重组质粒的构建 | 第18-19页 |
| 2.2.4 大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞的制备与转化 | 第19页 |
| 2.2.5 N-乙酰谷氨酸激酶在E. coli BL21中的表达与纯化 | 第19页 |
| 2.2.6 N-乙酰谷氨酸激酶的酶活测定 | 第19页 |
| 2.2.7 N-乙酰谷氨酸激酶的稳定性测定 | 第19-20页 |
| 2.2.8 N-乙酰谷氨酸激酶动力学参数的测定 | 第20页 |
| 2.2.9 CcNAGK受L-精氨酸的反馈抑制实验 | 第20页 |
| 2.2.10 N-乙酰谷氨酸激酶的三维结构模拟和分子对接及结构分析 | 第20页 |
| 2.2.11 钝齿棒杆菌感受态细胞的制备与电击转化 | 第20-21页 |
| 2.2.12 重组钝齿棒杆菌的构建 | 第21页 |
| 2.2.13 发酵过程中N-乙酰谷氨酸酶酶活的跟踪测定 | 第21页 |
| 2.2.14 发酵参数测定与分析 | 第21-22页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第22-49页 |
| 3.1 N-乙酰谷氨酸激酶结构模拟和分子对接及同源性比对 | 第22-26页 |
| 3.1.1 CcNAGK的三维结构模拟及分析 | 第22-23页 |
| 3.1.2 CcNAGK与底物和产物的分子对接及分析 | 第23-24页 |
| 3.1.3 CcNAGK的多序列同源比对 | 第24-26页 |
| 3.1.4 CcNAGK关键突变位点的选择 | 第26页 |
| 3.2 CcNAGK E19位点的饱和突变及解除反馈抑制机理解析 | 第26-32页 |
| 3.2.1 关键位点E19饱和突变重组质粒的构建与转化 | 第26-27页 |
| 3.2.2 关键位点E19饱和突变重组蛋白在E. coli BL21中的表达与纯化 | 第27-28页 |
| 3.2.3 L-精氨酸对CcNAGK野生型和饱和突变体的反馈抑制实验 | 第28-30页 |
| 3.2.4 CcNAGK野生型和饱和突变体的结构分析及其解除反馈抑制机理分析 | 第30-32页 |
| 3.3 CcNAGK活性位点G71/I74/F91的饱和突变对其催化活性和稳定性的影响 | 第32-43页 |
| 3.3.1 位点G71/I74/F91饱和突变重组质粒的构建 | 第32页 |
| 3.3.2 位点G71/I74/F91饱和突变重组蛋白在E. coli BL21中的表达与纯化 | 第32-33页 |
| 3.3.3 CcNAGK野生型和突变体催化效率的比较 | 第33-36页 |
| 3.3.4 CcNAGK野生型和突变体稳定性的比较 | 第36-38页 |
| 3.3.5 G71X饱和突变体的催化性能分析 | 第38-39页 |
| 3.3.6 I74X饱和突变体的催化性能分析 | 第39-41页 |
| 3.3.7 F91X饱和突变体的催化性能分析 | 第41-43页 |
| 3.4 位点K234的定点突变对CcNAGK热稳定性的影响 | 第43-44页 |
| 3.4.1 位点K234定点突变重组质粒的构建 | 第43页 |
| 3.4.2 位点K234定点突变重组蛋白在E. coli BL21中的表达与酶活测定 | 第43-44页 |
| 3.4.3 CcNAGK野生型和突变体的热稳定性比较 | 第44页 |
| 3.5 组合突变重组NAGK-EH3的构建与酶学性质 | 第44-45页 |
| 3.5.1 组合突变重组质粒的构建与表达 | 第44页 |
| 3.5.2 组合突变NAGK-EH3酶学性质的测定 | 第44-45页 |
| 3.6 重组钝齿棒杆菌SYPA-E19Y与SYPA-EH3发酵L-精氨酸性能比较 | 第45-49页 |
| 3.6.1 重组质粒pDXW10-argBE19Y与pDXW10-argBEH3的构建 | 第45-46页 |
| 3.6.2 重组钝齿棒杆菌SYPA-E19Y与SYPA-EH3的构建与验证 | 第46页 |
| 3.6.3 原始菌SYPA5-5 和重组菌SYPA-E19Y及SYPA-EH3产L-精氨酸比较 | 第46-49页 |
| 主要结论与展望 | 第49-51页 |
| 主要结论 | 第49-50页 |
| 展望 | 第50-51页 |
| 致谢 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-58页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第58页 |
