| 摘要 | 第3-8页 |
| Abstract | 第8-12页 |
| 前言 | 第17-21页 |
| 第一章 实验材料与方法 | 第21-52页 |
| 1 实验材料 | 第21-27页 |
| 1.1 实验试剂及耗材 | 第21-22页 |
| 1.2 TgPRMT5核酸序列 | 第22页 |
| 1.3 虫株、细胞系及实验动物 | 第22页 |
| 1.4 溶液 | 第22-26页 |
| 1.5 主要仪器 | 第26-27页 |
| 2 实验方法 | 第27-52页 |
| 2.0 宿主细胞HFF的培养 | 第27页 |
| 2.1 弓形虫Pru株缓殖子的收集与接种 | 第27-28页 |
| 2.2 弓形虫Pru株速殖子的收集与接种 | 第28页 |
| 2.3 弓形虫RH-PRMT5-HAX3虫株速殖子的体外培养 | 第28-29页 |
| 2.4 弓形虫RH-PRMT5-HAX3虫株缓殖子的体外诱导 | 第29页 |
| 2.5 PEASY-Blunt-Zero-PRMT5载体的构建 | 第29-34页 |
| 2.5.1 PCR引物的设计 | 第29页 |
| 2.5.2 总RNA提取 | 第29-30页 |
| 2.5.3 总RNA去基因组处理 | 第30页 |
| 2.5.4 目的基因PRMT5的RT-PCR扩增与纯化回收 | 第30-32页 |
| 2.5.5 连接及转化 | 第32-33页 |
| 2.5.6 阳性重组子的鉴定 | 第33-34页 |
| 2.6 RT-Real Time PCR检测弓形虫速、缓殖子中PRMT5的表达量 | 第34-35页 |
| 2.7 Westernblot检测PRMT5在RH-PRMT5-HAX3虫株速、缓殖子的表达水平 | 第35-36页 |
| 2.8 PRMT5在RH-PRMT5-HAX3虫株的速、缓殖子中的亚细胞定位 | 第36-38页 |
| 2.8.1 免疫荧光(IFA)检测PRMT5的亚细胞定位,步骤如下 | 第36-37页 |
| 2.8.2 Western blotting验证PRMT5在速殖子中的亚细胞定位 | 第37-38页 |
| 2.9 内源性PRMT5蛋白的收集 | 第38-40页 |
| 2.10 PRMT5免疫沉淀复合物鉴定 | 第40-41页 |
| 2.10.1 SDS-PAGE凝胶的银染色 | 第40页 |
| 2.10.2 Western blotting分析PRMT5免疫沉淀符合物 | 第40-41页 |
| 2.11 构建原核表运载体PET-32a-T巧3/ TgH4 | 第41-42页 |
| 2.11.1 Tg朋与TgH4基因全长片段的RT-PCR扩增及纯化回收 | 第41页 |
| 2.11.2 PET-32a-TgH3/TgH4的构建 | 第41-42页 |
| 2.11.3 阳性重组子PET-32a-TgH3/TgH4的筛选与鉴定 | 第42页 |
| 2.12 重组质粒PET-32a-TgH3/TgH4在大肠埃希菌中的表达 | 第42-43页 |
| 2.13 重组表达产物SDS-PAGE电泳 | 第43页 |
| 2.14 表达产物考马斯亮蓝染色以及Western blot分析 | 第43页 |
| 2.15 纯化收集重组表达蛋白 | 第43-44页 |
| 2.16 PRMT5体外甲基化实验 | 第44-45页 |
| 2.17 甲基化反应产物及弓形虫核蛋白Western blot分析 | 第45页 |
| 2.18 TgPRMT5表达量上调模型的建立 | 第45-48页 |
| 2.18.1 过表达载体TUB-CAT-PRMT5的构建 | 第45-46页 |
| 2.18.3 质粒TUB-CAT-PRMT5及TUB-CAT中量提取 | 第46-47页 |
| 2.18.4 重组质粒TUB-CAT-PRMT5及TUB-CAT转染RH株速殖子 | 第47-48页 |
| 2.18.5 Real Time RT-PCR检测PRMT5表达量 | 第48页 |
| 2.19 TgPRMT5表达量上调模型的建立 | 第48-52页 |
| 2.19.1 重组质粒pSAG1：：CAS9-U6：：sgPRMT5的构建与鉴定 | 第48-49页 |
| 2.19.2 PRMT5同源片段的构建 | 第49页 |
| 2.19.3 重组质粒pSAG1：：CAS9-U6：：sgPRMT5转染RH株速殖子 | 第49-50页 |
| 2.19.4 阳性克隆的筛选与鉴定 | 第50-52页 |
| 第二章 实验结果 | 第52-73页 |
| 1 弓形虫精氨酸甲基转移酶TgPRMT5基因的克隆、鉴定及其在速殖子与缓殖子期表达量的比较 | 第52-56页 |
| 1.1 PRMT5基因的克隆与鉴定 | 第52-53页 |
| 1.2 Real Time RT-PCR检测PRMT5基因在弓形虫速、缓殖子中的表达量 | 第53-55页 |
| 1.3Westernblot检测TgPRMT5在RH-PRMT5-HAX3虫株速殖子与缓殖子中的表达水平 | 第55-56页 |
| 2 PRMT5在弓形虫的亚细胞定位 | 第56-58页 |
| 2.1 免疫荧光(IFA)检测PRMT5的亚细胞定位 | 第56-57页 |
| 2.2 Western blot验证PRMT5在速殖子中的亚细胞定位 | 第57-58页 |
| 3 PRMT5酶学活性检测 | 第58-66页 |
| 3.1 弓形虫核蛋白对称二甲基化修饰位点的检测 | 第58-59页 |
| 3.2 PRMT5免疫沉淀复合物鉴定 | 第59-60页 |
| 3.3 rTgH3与rTgH4的重组表达与纯化 | 第60-65页 |
| 3.4 PRMT5二甲基化修饰组蛋白H3与H4 | 第65-66页 |
| 4 TgPRMT5表达量上调或下调后对弓形虫的影响 | 第66-73页 |
| 4.1 重组质粒TUB-CAT-PRMT5的构建 | 第66-67页 |
| 4.2 PRMT5表达量上调模型中PRMT5表达量的检测 | 第67-68页 |
| 4.3 质粒pSAG1：：CAS9-U6：：sgPRMT5的构建 | 第68-70页 |
| 4.4 同源片段的构建 | 第70-73页 |
| 第三章 结论与讨论 | 第73-76页 |
| 全文总结 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-82页 |
| 硕士期间研究成果 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
