| 致谢 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-11页 |
| Abstract | 第11-16页 |
| 目录 | 第16-21页 |
| 1 绪论 | 第21-52页 |
| ·水稻病毒概述 | 第21-31页 |
| ·水稻条纹叶枯病 | 第21-27页 |
| ·水稻条纹叶枯病的分布和危害 | 第21-22页 |
| ·RSV的生物学特征 | 第22页 |
| ·RSV的基因组结构和编码的蛋白 | 第22-26页 |
| ·RSV的侵染循环及昆虫传播介体灰飞虱研究 | 第26-27页 |
| ·南方水稻黑条矮缩病 | 第27-31页 |
| ·SRBSDV的发现和危害 | 第27-28页 |
| ·SRBSDV生物学特征 | 第28-29页 |
| ·SRBSDV基因组结构和编码的蛋白 | 第29-30页 |
| ·SRBSDV的昆虫传播介体 | 第30-31页 |
| ·病毒与介体昆虫的互作 | 第31-41页 |
| ·水稻与昆虫传播介体灰飞虱研究进展及传播类型 | 第31-32页 |
| ·非循徊型植物病毒介体昆虫传播机制 | 第32-33页 |
| ·循徊型植物病毒介体昆虫传播机制 | 第33-36页 |
| ·病毒与介体的互作及两者的互惠进化 | 第36-38页 |
| ·介体对植物病毒的防卫 | 第38-41页 |
| ·介体昆虫免疫机制介绍 | 第38-39页 |
| ·RNA干扰在昆虫抵抗病毒中的作用 | 第39-40页 |
| ·泛素化蛋白酶途径在病毒侵染中的作用 | 第40-41页 |
| ·RNA沉默途径 | 第41-48页 |
| ·RNA沉默是抵御病毒侵染的固有机制 | 第41-42页 |
| ·病毒产生的小RNA | 第42-48页 |
| ·小RNA的来源 | 第42-44页 |
| ·小RNA的生成 | 第44-45页 |
| ·小RNA的修饰 | 第45-46页 |
| ·小RNA的运输 | 第46页 |
| ·RISC的组装及靶标识别 | 第46-47页 |
| ·次级小RNA的产生 | 第47-48页 |
| ·病毒编码的运动蛋白 | 第48-52页 |
| ·植物病毒编码的运动蛋白及作用方式 | 第48-49页 |
| ·运动蛋白和细胞骨架的联系 | 第49-51页 |
| ·运动蛋白的其他功能 | 第51-52页 |
| 2 白背飞虱转录组及感染SRBSDV后基因表达差异比较 | 第52-69页 |
| ·材料与方法 | 第52-56页 |
| ·病毒样品的采集,植物和昆虫培养 | 第52页 |
| ·样品的准备和RNA的提取 | 第52-53页 |
| ·白背飞虱cDNA文库的制备和Illumia测序 | 第53-54页 |
| ·简单重复序列分析(simple sequence repeats analysis,SSR) | 第54-55页 |
| ·比较分析基因的表达量 | 第55页 |
| ·荧光定量PCR(qRT-PCR)验证差异基因 | 第55-56页 |
| ·结果与分析 | 第56-68页 |
| ·Illumia测序结果概述及序列的拼接 | 第56-57页 |
| ·Unigene的蛋白注释 | 第57-58页 |
| ·Gene Ontology(GO)分析 | 第58-59页 |
| ·潜在的分子标记分析 | 第59-60页 |
| ·白背飞虱携带SRBSDV后在整个转录组水平表达的改变 | 第60-68页 |
| ·白背飞虱初级代谢基因下调表达 | 第63-64页 |
| ·干扰细胞循环以及泛素化蛋白酶途径 | 第64-66页 |
| ·SRBSDV侵染影响了寄主细胞骨架系统 | 第66-67页 |
| ·SRBSDV侵染激活寄主体液、细胞免疫防卫反应及RNA干扰途径 | 第67-68页 |
| ·结论 | 第68-69页 |
| 3 RSV NS3蛋白和灰飞虱互作蛋白RPN3研究 | 第69-104页 |
| ·材料与方法 | 第69-81页 |
| ·菌株和质粒 | 第69页 |
| ·灰飞虱cDNA文库构建 | 第69-71页 |
| ·灰飞虱总RNA提取 | 第69页 |
| ·灰飞虱mRNA分离和纯化 | 第69-70页 |
| ·灰飞虱cDNA的合成及文库制备 | 第70-71页 |
| ·酵母双杂交的诱饵载体构建及酵母转化 | 第71-72页 |
| ·诱饵载体pGBKT7-NS3的构建 | 第71页 |
| ·质粒转化酵母 | 第71-72页 |
| ·诱饵蛋白毒性及自激活检测 | 第72页 |
| ·用融合法进行酵母双杂交筛库 | 第72页 |
| ·灰飞虱基因全长克隆 | 第72-74页 |
| ·转录组文库搜索 | 第72页 |
| ·5'-RACEPCR | 第72-73页 |
| ·Overlap PCR构建点突变体 | 第73-74页 |
| ·Pull-down试验验证互作 | 第74-75页 |
| ·载体构建 | 第74页 |
| ·原核表达外源目标蛋白 | 第74-75页 |
| ·Pull-down试验 | 第75页 |
| ·灰飞虱器官、组织分离 | 第75页 |
| ·沉默抑制子活性检测 | 第75页 |
| ·酵母互补试验 | 第75-76页 |
| ·血球计数板计数 | 第76页 |
| ·酵母总蛋白泛素化试验 | 第76-77页 |
| ·酵母总蛋白提取 | 第76页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第76-77页 |
| ·蛋白泛素化检测 | 第77页 |
| ·运用注射双链RNA介导的沉默技术沉默昆虫RPN3 | 第77-78页 |
| ·Northern blot分析 | 第78-80页 |
| ·RNA的甲醛变性凝胶电泳 | 第78页 |
| ·RNA转膜 | 第78-79页 |
| ·RNA的预杂交和杂交 | 第79-80页 |
| ·qRT-PCR检测 | 第80页 |
| ·灰飞虱传毒试验 | 第80页 |
| ·半乳糖苷酶活性测定 | 第80-81页 |
| ·质粒转化酵母 | 第80页 |
| ·酵母总蛋白提取 | 第80-81页 |
| ·半乳糖苷酶活性定量 | 第81页 |
| ·生物信息学分析及系统进化分析 | 第81页 |
| ·结果与分析 | 第81-102页 |
| ·灰飞虱文库构建和酵母筛库 | 第81-83页 |
| ·克隆RPN3全长及酵母双杂交验证 | 第83-85页 |
| ·转录组文库寻找RPN3全长 | 第83页 |
| ·5’-RACE克隆RPN3全长 | 第83-84页 |
| ·RPN3序列分析 | 第84页 |
| ·全长RPN3也能和NS3互作 | 第84-85页 |
| ·Pull-down方法验证NS3和RPN3互作 | 第85-86页 |
| ·NS3与RPN3互作区域确定 | 第86-88页 |
| ·NS3和RPN3互作是特异的 | 第88-89页 |
| ·RPN5和RPN12的克隆 | 第88页 |
| ·酵母双杂交验证NS3和RPN5和RPN12的互作 | 第88-89页 |
| ·RPN3基因在灰飞虱中的表达特性分析 | 第89-90页 |
| ·RPN3基因组织特异性表达 | 第89页 |
| ·RPN3基因在不同龄期及成虫灰飞虱中表达情况 | 第89-90页 |
| ·RPN3对NS3抑制子功能无影响 | 第90-91页 |
| ·酵母互补试验及NS3对互补的影响 | 第91-94页 |
| ·rpn3突变型酵母YE101的互补 | 第91-92页 |
| ·NS3对灰飞虱RPN3互补的影响 | 第92-94页 |
| ·NS3影响灰飞虱RPN3互补的酵母蛋白泛素化及降解蛋白能力 | 第94-97页 |
| ·NS3影响灰飞虱RPN3互补的YE101酵母总蛋白泛素化水平 | 第94-96页 |
| ·NS3影响灰飞虱RPN3互补的YE101酵母蛋白降解功能 | 第96-97页 |
| ·在RPN3基因表达受抑制的带毒灰飞虱中RSV的含量升高 | 第97-98页 |
| ·带毒灰飞虱RPN3被沉默后传毒能力提高 | 第98-99页 |
| ·自然界存在RPN3 433位氨基酸点突变的灰飞虱 | 第99-101页 |
| ·RSV和灰飞虱之间博弈 | 第101-102页 |
| ·讨论 | 第102-104页 |
| 4 RSV在三种寄主中产生小RNA多样性分析及灰飞虱中RNA干扰介导的抗病毒机制 | 第104-124页 |
| ·材料与方法 | 第104-110页 |
| ·病毒样品的采集 | 第104页 |
| ·病毒接种 | 第104-105页 |
| ·总RNA提取及小RNA的分离 | 第105-106页 |
| ·昆虫总RNA的提取 | 第105页 |
| ·病叶组织总RNA的提取 | 第105页 |
| ·小RNA的分离和纯化 | 第105-106页 |
| ·sRNA文库的构建和Illumia测序 | 第106-108页 |
| ·小RNA 5’端去磷酸化 | 第106页 |
| ·小RNA 3’端加接头 | 第106-107页 |
| ·小RNA 5’端重磷酸化和加接头 | 第107页 |
| ·小RNA的扩增 | 第107-108页 |
| ·产物纯化和Illumia测序 | 第108页 |
| ·小RNA分析及病毒基因组二级结构预测 | 第108页 |
| ·Northern blot | 第108-109页 |
| ·克隆鉴定灰飞虱的Dicer,Agonaute基因 | 第109页 |
| ·Dicer,AGO系统发育分析及核苷酸同源性分析 | 第109页 |
| ·运用注射双链RNA介导的沉默技术沉默昆虫基因 | 第109-110页 |
| ·结果与分析 | 第110-123页 |
| ·sRNA文库概况 | 第110-111页 |
| ·RSV来源的sRNA的分布 | 第111-115页 |
| ·病毒源sRNA在三种寄主中的含量差异 | 第111-113页 |
| ·病毒源sRNA的分布概况 | 第113页 |
| ·RSV来源的sRNA 5’末端核苷酸组成 | 第113-115页 |
| ·病毒源sRNA的极性分布 | 第115-116页 |
| ·sRNA在病毒基因组上热点区分布 | 第116-120页 |
| ·在水稻和本氏烟上特异性产生一类24nt的病毒源小RNA | 第120页 |
| ·灰飞虱Dicer 2和Argonaute 2基因克隆和分析 | 第120-123页 |
| ·RSV病毒在AGO 2被沉默的灰飞虱中含量上升 | 第123页 |
| ·结论 | 第123-124页 |
| 5 RSV NSvc4运动蛋白在本氏烟胞内运动机制探索及症状形成研究 | 第124-140页 |
| ·材料与方法 | 第124-128页 |
| ·质粒构建 | 第124-125页 |
| ·浸润和共聚焦观察 | 第125页 |
| ·抑制剂处理 | 第125页 |
| ·常温包埋及电镜观察 | 第125-126页 |
| ·常温包埋 | 第125-126页 |
| ·样品的超薄切片 | 第126页 |
| ·超薄切片的染色 | 第126页 |
| ·切片电镜观察 | 第126页 |
| ·构建NSvc4的杆状病毒表达载体及转染Sf-9昆虫细胞 | 第126-128页 |
| ·软件预测NSvc4蛋白质跨膜结构 | 第128页 |
| ·结果和分析 | 第128-138页 |
| ·微丝和内膜系统在NSvc4胞间连丝定位和RSV系统侵染本氏烟中发挥重要作用 | 第128-130页 |
| ·软件分析NSvc4蛋白 | 第130-131页 |
| ·分析NSvc4决定定位在胞间连丝的结构域 | 第131页 |
| ·NSvc4能够形成一些环状的结构且位于叶绿体上 | 第131-134页 |
| ·PVX表达NSvc4在本氏烟上产生严重的症状 | 第134-136页 |
| ·PVX表达NSvc4产生的症状不依赖于叶绿体定位 | 第136-137页 |
| ·NSvc4不能在Sf-9细胞里形成管状结构 | 第137-138页 |
| ·讨论 | 第138-140页 |
| 6 RSV沉默抑制子NS3抑制基因沉默的机制研究 | 第140-148页 |
| ·材料与方法 | 第140-142页 |
| ·NS3及11个突变体的克隆及其表达载体构建 | 第140页 |
| ·农杆菌瞬时表达观察基因沉默抑制子效果 | 第140-141页 |
| ·Northern blot | 第141页 |
| ·SDS-PAGE电泳及Western blot分析 | 第141-142页 |
| ·尿素法植物总蛋白提取 | 第141页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第141页 |
| ·湿法转膜 | 第141页 |
| ·Western blot分析 | 第141-142页 |
| ·结果与分析 | 第142-147页 |
| ·EMSA检测突变体结合小RNA能力 | 第142-143页 |
| ·在普通本氏烟上检测NS3及突变体沉默抑制效果 | 第143-145页 |
| ·在转GFP本氏烟16c上检测NS3抑制子情况 | 第145-147页 |
| ·讨论 | 第147-148页 |
| 7 全文小结 | 第148-150页 |
| 参考文献 | 第150-170页 |
| 附录A 论文所用术语缩写词及中英文对照 | 第170-172页 |
| 附录B 本论文所用病毒缩写及中英文对照 | 第172-173页 |
| 附录C 常用缓冲液和培养基配方 | 第173-178页 |
| 作者简历及攻读博士学位期间发表论文 | 第178页 |
