| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-12页 |
| 前言 | 第12-17页 |
| 1 红鳍笛鲷简介 | 第12页 |
| 2 国内外研究现状分析 | 第12-15页 |
| ·生长激素 | 第12-13页 |
| ·胰岛素样生长因子（IGF） | 第13-14页 |
| ·GH/ IGF 轴 | 第14-15页 |
| ·重组生长激素促生长作用研究 | 第15页 |
| 3 本文研究的目的与意义 | 第15-17页 |
| 第一部分 生长激素和胰岛素生长因子基因全序列获得 | 第17-31页 |
| 1 实验材料 | 第17-18页 |
| ·动物材料 | 第17页 |
| ·主要试剂 | 第17页 |
| ·菌株和质粒 | 第17页 |
| ·主要仪器设备 | 第17-18页 |
| ·溶液及其配制方法 | 第18页 |
| ·培养基及其配制方法 | 第18页 |
| 2 实验方法 | 第18-24页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 基因和 IGFⅠ基因全长 CDNA 的获得 | 第18-22页 |
| ·红鳍笛鲷脑垂体和肝脏总 RNA 的提取 | 第18-19页 |
| ·反转录 cDNA 第一链的合成 | 第19页 |
| ·引物设计和 RT-PCR 扩增 cDNA | 第19页 |
| ·3'端和 5'端序列的扩增 | 第19-22页 |
| ·PCR 产物胶回收和连接 | 第22页 |
| ·DH5Α感受态的制备和转化 | 第22-23页 |
| ·CaCl2法制备大肠杆菌感受态： | 第22-23页 |
| ·连接产物的转化 | 第23页 |
| ·菌液 PCR 鉴定阳性克隆和序列测定 | 第23页 |
| ·序列分析 | 第23-24页 |
| ·蛋白结构 B 细胞抗原表位的预测 | 第24页 |
| ·GH 和 IGFⅠ的 B 细胞表位预测 | 第24页 |
| ·GH 和 IGF 蛋白二级结构及 3D 模型预测 | 第24页 |
| 3 结果 | 第24-30页 |
| ·红鳍笛鲷垂体组织和肝组织中 RNA 获得： | 第24页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 基因和 IGFⅠ基因 cDNA 全长的获得 | 第24-26页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 基因和 IGF 基因序列分析 | 第26页 |
| ·蛋白结构 B 细胞抗原表位的预测： | 第26-30页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 和 IGFⅠ蛋白二级结构可能区域预测 | 第26-27页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 和 IGFⅠ蛋白的 B 细胞表位可能性预测结果 | 第27-28页 |
| ·GH 和 IGFⅠ蛋白结构分析 | 第28-29页 |
| ·蛋白 3D 模型在线预测结果 | 第29-30页 |
| ·信号肽预测结果 | 第30页 |
| 4 小结 | 第30-31页 |
| 第二部分 红鳍笛鲷生长激素（GH）基因的真核表达 | 第31-45页 |
| 1 实验材料 | 第31-32页 |
| ·主要试剂 | 第31页 |
| ·载体和菌株 | 第31页 |
| ·仪器 | 第31页 |
| ·溶液及其配制方法 | 第31-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-44页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 真核表达载体的构建 | 第32-35页 |
| ·引物设计 | 第32页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 基因 cDNA 扩增与克隆 | 第32-33页 |
| ·质粒 DNA 的提取 | 第33页 |
| ·表达载体和目的片段的双酶切 | 第33-34页 |
| ·表达载体 pPICZαA 和目的片段的去磷酸化 | 第34页 |
| ·回收目的片段 | 第34页 |
| ·T4 连接酶连接 | 第34-35页 |
| ·重组 GH 在毕赤酵母中的表达 | 第35-39页 |
| ·毕赤酵母表达所需各种母液的配制 | 第35页 |
| ·常用溶液及缓冲夜 | 第35-36页 |
| ·毕赤酵母表达的培养基配制 | 第36页 |
| ·重组质粒的转化大肠杆菌 | 第36页 |
| ·重组质粒的菌液 PCR 鉴定及测序 | 第36-37页 |
| ·阳性菌株质粒的再转化 | 第37页 |
| ·电转菌体的准备： | 第37页 |
| ·电击转化 | 第37页 |
| ·重组子筛选 | 第37-38页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达 | 第38页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 | 第38-39页 |
| ·表达条件的优化 | 第39页 |
| ·重组红鳍笛鲷生长激素(GH)毕赤酵母促生长研究 | 第39页 |
| ·实验结果 | 第39-44页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 基因编码区 cDNA 的扩增 | 第39-40页 |
| ·重组后质粒的酶切鉴定 | 第40页 |
| ·表达载体的构建 | 第40页 |
| ·表达产物的确定 | 第40-41页 |
| ·表达条件的优化 | 第41-43页 |
| ·重组红鳍笛鲷生长激素(GH)毕赤酵母促生长研究 | 第43-44页 |
| 3 小结 | 第44-45页 |
| 第三部分 讨论 | 第45-53页 |
| 1 红鳍笛鲷 GH 基因和 IGFⅠ基因全序列的获得 | 第45-47页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 基因和 IGFⅠ基因部分序列的获得 | 第45页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 基因和 IGFⅠ基因 3’ RACE 序列的获得 | 第45页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 基因和 IGFⅠ基因 5’ RACE 序列的获得 | 第45-46页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 基因和 IGFⅠ基因序列拼接 | 第46页 |
| ·红鳍笛鲷 GH、IGFⅠ二级结构和 B 细胞表位以及 3D 结构预测 | 第46-47页 |
| 2 GH 真核表达 | 第47-53页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 基因改造和 PCR 扩增 | 第47页 |
| ·毕赤酵母表达体系 | 第47页 |
| ·外源基因在酵母中表达的实现： | 第47-48页 |
| ·菌株和表达质粒的选择 | 第48页 |
| ·酵母的转化方法 | 第48-49页 |
| ·转化子的表型及产生 | 第48-49页 |
| ·重组转化子的筛选 | 第49页 |
| ·毕赤酵母表达外源蛋白的机理 | 第49-50页 |
| ·毕赤酵母的甲醉代谢和醉氧化酶启动子 | 第49页 |
| ·外源基因的诱导表达 | 第49-50页 |
| ·影响外源蛋白在毕赤醉母中表达的因素 | 第50-51页 |
| ·红鳍笛鲷 GH 在毕赤酵母中分泌表达 | 第51页 |
| ·重组 GH 在鱼体的吸收及促鱼生长作用 | 第51-53页 |
| 第四部分 结论 | 第53-54页 |
| 1 结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-60页 |
| 附录Ⅰ | 第60页 |
| 附录Ⅱ | 第60-61页 |
| 附录Ⅲ | 第61-62页 |
| 附录Ⅳ | 第62-63页 |
| 附录Ⅴ | 第63-64页 |
| 附录Ⅵ | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 作者简介 | 第66-67页 |
| 导师简介 | 第67页 |
