| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-8页 |
| 1 前言 | 第8-13页 |
| ·HCMV与UL49 | 第8页 |
| ·RNaseP简介 | 第8-11页 |
| ·DNA-based EGS | 第11-12页 |
| ·课题意义 | 第12-13页 |
| 2 技术路线 | 第13-14页 |
| 3 实验仪器与材料 | 第14-17页 |
| ·主要仪器 | 第14页 |
| ·主要实验材料 | 第14-15页 |
| ·主要实验试剂 | 第15-17页 |
| 4 实验方法 | 第17-32页 |
| ·pEGFP-UL49的克隆 | 第17-22页 |
| ·PCR扩增分离UL49基因 | 第17-18页 |
| ·纯化ULA9基因片段 | 第18页 |
| ·pEGFP—N1质粒抽提 | 第18-19页 |
| ·酶切处UL49基因片段及pEGFP—N1载体 | 第19-20页 |
| ·构建pEGFP—UL49质粒 | 第20页 |
| ·重组子的转化及鉴定 | 第20-22页 |
| ·制备感受态细胞 | 第20-21页 |
| ·转化重组DNA | 第21-22页 |
| ·扩大培养阳性质粒菌落并抽提质粒 | 第22页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定 | 第22页 |
| ·重组质粒测序 | 第22页 |
| ·EGS的设计 | 第22-23页 |
| ·设计原则 | 第22-23页 |
| ·所设计序列 | 第23页 |
| ·共转染Hela细胞 | 第23-32页 |
| ·Hela细胞的培养 | 第23-25页 |
| ·Hela细胞的复苏 | 第24页 |
| ·Hela细胞的培养与传代 | 第24页 |
| ·Hela细胞的铺板 | 第24-25页 |
| ·质粒的制备 | 第25页 |
| ·各EGS对ULA9基因表达的抑制作用 | 第25-32页 |
| ·转染Hela细胞 | 第25-26页 |
| ·荧光显微镜下观察 | 第26页 |
| ·流式细胞仪检测 | 第26页 |
| ·荧光定量PCR检测 | 第26-32页 |
| ·总RNA的抽提 | 第27页 |
| ·加入DNaseⅠ消化,去除DNA污染 | 第27-28页 |
| ·逆转录 | 第28-29页 |
| ·RT-PCR检测 | 第29-30页 |
| ·荧光定量PCR | 第30-32页 |
| 5 结果与分析 | 第32-44页 |
| ·pEGFP—UL49融合质粒构建 | 第32-34页 |
| ·PCR分离HCMVUL49基因 | 第32-33页 |
| ·pEGFP-UL49重组质粒的双酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·EGS的设计 | 第34页 |
| ·EGS对HCMVUL49基因表达的抑制作用 | 第34-44页 |
| ·荧光检测法测定EGFP-UL49的表达水平 | 第35-38页 |
| ·荧光显微镜检测EGFP-UL49的表达 | 第35-36页 |
| ·流式细胞仪检测EGFP-UL49的表达 | 第36-38页 |
| ·荧光定量PCR检测UL49基因的表达水平 | 第38-44页 |
| 验证所提取总RNA无DNA污染: | 第39-40页 |
| ·逆转录样本的检测 | 第40-41页 |
| ·荧光定量PCR分析UL49的表达 | 第41-44页 |
| 6 讨论 | 第44-49页 |
| ·EGS的设计 | 第44-46页 |
| ·脂质体转染 | 第46页 |
| ·EGS浓度的选择 | 第46-47页 |
| ·流式细胞仪检测与荧光定量PCR检测的差异 | 第47-48页 |
| ·胞内试验的意义 | 第48-49页 |
| 7 结论与展望 | 第49-50页 |
| 8 附录 | 第50-54页 |
| ·附录1:HCMV(AD169)UL49在genebank登录的序列 | 第50-52页 |
| ·附录2:pEGFP-UL49质粒测序结果 | 第52-54页 |
| 9 参考文献 | 第54-57页 |
| 致谢: | 第57页 |