| 中文摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 引言 | 第10-19页 |
| 第一部分 dok5基因的克隆表达及其PTB domain的三维晶体结构解析与相关功能研究 | 第19-40页 |
| 第一章 dok5基因及其PTB domain的克隆、表达和结晶 | 第19-33页 |
| 1.材料和方法 | 第19-23页 |
| ·全长dok5 cDNA的获得 | 第19页 |
| ·dok5亚克隆原核表达载体的构建及表达 | 第19-20页 |
| ·引物设计 | 第19-20页 |
| ·表达克隆的构建 | 第20页 |
| ·各蛋白的小量表达 | 第20页 |
| ·Northern杂交 | 第20页 |
| ·GST融合蛋白的大量表达及初步的亲和纯化 | 第20-21页 |
| ·GST融合蛋白的大量表达 | 第20-21页 |
| ·GST融合蛋白的初步亲和纯化 | 第21页 |
| ·dok5 PTB domain及PTB domain+部分C末端GST融合蛋白的进一步纯化 | 第21页 |
| ·dok5 PTB domain晶体的生长 | 第21-22页 |
| ·dok5 PTB domain Se-Met衍生物样品制备及晶体生长 | 第22-23页 |
| ·菌体生长及蛋白表达 | 第22页 |
| ·蛋白的分离纯化 | 第22页 |
| ·dok5 PTB domain Se-Met衍生物的晶体生长 | 第22-23页 |
| 2.结果 | 第23-33页 |
| ·全长dok5 cDNA的获得 | 第23-25页 |
| ·dok5亚克隆原核表达载体的构建及表达结果 | 第25-27页 |
| ·表达载体的构建结果 | 第25-26页 |
| ·dok5蛋白的原核表达结果 | 第26-27页 |
| ·组织表达谱初步分析结果 | 第27页 |
| ·GST融合蛋白的大量表达及初步的亲和纯化结果 | 第27-28页 |
| ·dok5 PTB domain及PTB domain+部分C末端GST融合蛋白的纯化结果 | 第28-31页 |
| ·蛋白的色谱纯化结果 | 第28-30页 |
| ·蛋白的基本参数及性质 | 第30-31页 |
| ·dok5 PTB domain晶体的生长 | 第31页 |
| ·dok5 PTB domain Se-Met衍生物样品制备及晶体生长 | 第31-33页 |
| 第二章 dok5 PTB domain晶体的数据收集、处理和结构解析 | 第33-40页 |
| 1 晶体衍射数据的收集与处理 | 第33-35页 |
| ·dok5 PTB native数据收集与处理 | 第33-34页 |
| ·dok5 PTB Se-Met衍生物晶体衍射数据收集及处理 | 第34-35页 |
| 2.用多波长反常散射法解析结构 | 第35-40页 |
| ·硒原子位置的确定及密度图的修正 | 第35-36页 |
| ·模型的搭建 | 第36页 |
| ·结构修正 | 第36-37页 |
| ·最终模型质量的验证和分 | 第37-40页 |
| 第二部分 dok1基因的克隆表达及其PTB domain的三维晶体结构解析与相关功能研究 | 第40-72页 |
| 第一章 dok1全长及其PTB domain的克隆、表达、纯化和结晶 | 第40-49页 |
| 1 材料和方法 | 第40-42页 |
| ·引物设计 | 第40页 |
| ·dok1全长及PTB结构域的原核表达载体的构建 | 第40页 |
| ·his融合蛋白的大量表达及纯化 | 第40-41页 |
| ·蛋白表达 | 第40-41页 |
| ·蛋白的分离纯化 | 第41页 |
| ·dok1 PTB domain晶体的生长 | 第41页 |
| ·dok1 PTB Se-Met衍生物样品制备及晶体生长 | 第41-42页 |
| ·dok1 PTB Se-Met衍生物菌体生长及蛋白表达 | 第41-42页 |
| ·dok1 PTB Se-Met衍生物蛋白的分离纯化 | 第42页 |
| ·dok1 PTB Se-Met衍生物蛋白的晶体生长 | 第42页 |
| 2.结果 | 第42-49页 |
| ·dok1蛋白的原核表达结果 | 第42-43页 |
| ·dok1蛋白纯化结果 | 第43-45页 |
| ·蛋白的基本参数及性质 | 第45-46页 |
| ·dok1 PTB domain晶体的生长 | 第46-48页 |
| ·dok1 PTB domain Se-Met衍生物样品制备及晶体生长 | 第48-49页 |
| 第二章 dok1 PTB domain晶体的数据收集、处理和结构解析 | 第49-63页 |
| 1.晶体衍射数据的收集与处理 | 第49-55页 |
| ·dok1 PTB native晶体的数据收集与处理 | 第49-50页 |
| ·Dok1 PTB Se-Met衍生物晶体衍射数据收集及处理 | 第50-55页 |
| 2.用多波长反常散射法解析结构 | 第55-63页 |
| ·硒原子位置的确定 | 第55-56页 |
| ·密度图的修正 | 第56-57页 |
| ·模型的搭建 | 第57-58页 |
| ·结构修正 | 第58页 |
| ·最终模型质量的验证和分析 | 第58-63页 |
| 第三章 dok1 PTB domain与Ret衍生磷酸肽复合物晶体的数据收集、处理和结构解析 | 第63-72页 |
| 1.数据收集与处理 | 第63-64页 |
| 2.用分子置换解析结构 | 第64-72页 |
| ·旋转函数和平移函数的求解 | 第64-66页 |
| ·结构修正 | 第66-69页 |
| ·最终模型质量分析 | 第69-72页 |
| 第三部分 dok1与dok5 PTB domain与磷酸肽的结合及其结构与相关功能的讨论 | 第72-101页 |
| 第一章 biacore测定dok1与dok5 PTB domain与磷酸肽的结合 | 第72-80页 |
| 1.实验原理 | 第72-73页 |
| 2.实验材料及方法 | 第73页 |
| ·多肽合成 | 第73页 |
| ·SPR测定： | 第73页 |
| 3.结果分析及讨论 | 第73-80页 |
| 第二章 dok1与dok5 PTB domain的晶体结构分析 | 第80-101页 |
| 1.Dok1 PTB domain的结构特征 | 第80-85页 |
| 2.磷酸肽的结构特征及其与PTB domain的结合特征 | 第85-90页 |
| ·肽识别 | 第85-87页 |
| ·磷酸酪氨酸的识别 | 第87-90页 |
| 3.dok5 PTB domain的结构特征 | 第90-94页 |
| 4.和其它PTB domain的比较 | 第94-96页 |
| 5.和Ph domain的比较 | 第96页 |
| 6.和其他类似domain的比较 | 第96-97页 |
| 7.和SH2 domain的比较 | 第97页 |
| 8.关于dok蛋白功能以及dok5结合特性的推测的讨论： | 第97-101页 |
| 工作总结 | 第101-102页 |
| 附录 蛋白质晶体学原理和方法 | 第102-123页 |
| 1.蛋白质结构测定的主要过程 | 第102-103页 |
| 2.蛋白质结晶的原理和技术 | 第103-108页 |
| ·蛋白质结晶的原理 | 第103-104页 |
| ·结晶方法和技术 | 第104-106页 |
| ·蛋白结晶条件的筛选 | 第106-107页 |
| ·蛋白质结晶条件的优化 | 第107-108页 |
| 3.蛋白质晶体的衍射和数据的收集 | 第108-109页 |
| 4.结构解析中相位的求解 | 第109-118页 |
| ·多对同晶置换法(MIR) | 第110-111页 |
| ·多波长反常散射法(MAD) | 第111-117页 |
| ·多波长反常散射法原 | 第111-115页 |
| ·硒代甲硫氨酸蛋白质的制备 | 第115-117页 |
| ·Se-Met蛋白衍生物的表达 | 第115-116页 |
| ·Se-Met蛋白衍生物的纯化 | 第116页 |
| ·Se-Met蛋白衍生物的结晶与保存 | 第116页 |
| ·甲硫氨酸位点的引入 | 第116-117页 |
| ·分子置换法(MR) | 第117-118页 |
| 5 蛋白晶体结构修正 | 第118-119页 |
| 6.模型质量分析 | 第119-120页 |
| 7.后基因组时代的蛋白质晶体学 | 第120-123页 |
| ·结构基因组学 | 第120页 |
| ·蛋白质晶体学相关技术的新发展 | 第120-123页 |
| ·高通量蛋白质表达和纯化 | 第120页 |
| ·高通量结晶 | 第120-121页 |
| ·数据收集的快速和自动化 | 第121页 |
| ·结构解析的快速和自动化 | 第121-122页 |
| ·新软件的开发和应用 | 第122-123页 |
| 参考文献 | 第123-128页 |
| 综述 | 第128-136页 |
| 发表文章及会议摘要 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137页 |
