| 中文摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-8页 |
| 1 前言 | 第8-13页 |
| ·多位点基因打靶技术 | 第8-10页 |
| ·锌指核酸酶的研究 | 第10-12页 |
| ·核定位信号(NLS)的研究 | 第12-13页 |
| 2 材料和方法 | 第13-33页 |
| ·材料和仪器 | 第13-20页 |
| ·菌株和质粒 | 第13页 |
| ·主要试剂 | 第13-15页 |
| ·其它主要试剂配方 | 第15-19页 |
| ·主要仪器 | 第19-20页 |
| ·技术路线 | 第20-21页 |
| ·一对锌指核酸酶的真核表达载体的构建 | 第20页 |
| ·基因打靶载体的构建 | 第20页 |
| ·细胞转染 | 第20-21页 |
| ·实验方法 | 第21-33页 |
| ·打靶位点的选择 | 第21页 |
| ·针对靶位点的锌指蛋白的设计 | 第21-23页 |
| ·pcDNA3.1-NLS的构建 | 第23-25页 |
| ·锌指核酸酶真核表达载体pcS-ZFNs的构建 | 第25-26页 |
| ·基因打靶载体的构建 | 第26-30页 |
| ·pcS-ZFNs和基因打靶载体的共转染 | 第30-33页 |
| 3 结果与分析 | 第33-41页 |
| ·锌指核酸酶真核表达载体pcS-ZFNs的构建 | 第33-34页 |
| ·pcDNA3.1-NLS的构建 | 第33页 |
| ·一对pcS-ZFNs的构建 | 第33-34页 |
| ·基因打靶载体的构建 | 第34-36页 |
| ·DS1、DS2和pCMV-EGFP的PCR扩增及鉴定 | 第35页 |
| ·基因打靶载体pMD19-DS1-pCMV-EGFP-DS2的构建 | 第35-36页 |
| ·细胞转染及定点整合验证 | 第36-41页 |
| ·HEK293细胞内的共转染 | 第36-37页 |
| ·基因定点整合鉴定 | 第37-38页 |
| ·共转染条件的优化 | 第38页 |
| ·共转染细胞定点整合效率的检测 | 第38-41页 |
| 4 讨论 | 第41-47页 |
| ·基因打靶位点的选择 | 第41页 |
| ·ZFN序列的设计及拼接 | 第41-42页 |
| ·pcS-ZFN真核表达载体的构建 | 第42-43页 |
| ·高GC含量的两条同源臂的扩增 | 第43页 |
| ·增强型报告基因EGFP的选用 | 第43-44页 |
| ·HEK293细胞的共转染 | 第44-45页 |
| ·基因打靶定点整合的鉴定 | 第45页 |
| ·多位点基因打靶的意义 | 第45-47页 |
| 5 结论 | 第47-48页 |
| 6 参考文献 | 第48-52页 |
| 7 附录 | 第52-64页 |
| 附录1 人rDNA基因家族全序列 | 第52-56页 |
| 附录2 pcDNA3.1-S-ZFN测序结果 | 第56-58页 |
| ·pcDNA3.1-S-ZFNL测序结果 | 第56-57页 |
| ·pcDNA3.1-S-ZFNR测序结果 | 第57-58页 |
| 附录3 pCMV-EGFP及同源引导臂DS1和DS2的测序结果 | 第58-60页 |
| ·pMD19-pCMV-EGFP的测序结果 | 第58-59页 |
| ·pMD19-DS1的测序结果 | 第59页 |
| ·pMD19-DS2的测序结果 | 第59-60页 |
| 附录4 验证PCR的测序结果(针对DS2) | 第60-61页 |
| ·以引物Bu进行的验证测序结果:引物Bu | 第60页 |
| ·以引物Bd进行的验证测序结果:引物Bd | 第60-61页 |
| 附录5 定点整合后的靶位点序列 | 第61-64页 |
| 英文缩略词表 | 第64-66页 |
| 在学期间发表论文清单 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
