| 中文摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-6页 |
| 中文文摘 | 第6-9页 |
| 目录 | 第9-14页 |
| 绪论 | 第14-26页 |
| 一 高度不饱和脂肪酸 | 第14-15页 |
| 二 PUFAs主要生理功能 | 第15页 |
| 三 高度不饱和脂肪酸生物合成途径 | 第15-17页 |
| ·脂肪酸碳链延长酶和脱饱和酶共催化的生物合成途径 | 第15-16页 |
| ·Polyketide synthase(PKS)脂肪酸生物合成途径 | 第16-17页 |
| 四 脂肪酸脱饱和酶的研究进展 | 第17-21页 |
| ·脂肪酸脱饱和酶 | 第17页 |
| ·脂肪酸脱饱和酶的结构特征 | 第17-18页 |
| ·脂肪酸脱饱和酶的分子生物学研究进展 | 第18-21页 |
| ·△15-脂肪酸脱饱和酶 | 第18-19页 |
| ·△12-脂肪酸脱饱和酶 | 第19页 |
| ·△9-脂肪酸脱饱和酶 | 第19页 |
| ·△8-脂肪酸脱饱和酶 | 第19-20页 |
| ·△6-脂肪酸脱饱和酶 | 第20页 |
| ·△5-脂肪酸脱饱和酶 | 第20-21页 |
| ·△4-脂肪酸脱饱和酶 | 第21页 |
| 五 脂肪酸脱饱和酶基因启动子的研究进展 | 第21-22页 |
| 六 本课题研究的目的和意义 | 第22-24页 |
| 七 本课题研究的技术路线 | 第24-26页 |
| 第一章 Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径△5-脱饱和酶基因的克隆与分析 | 第26-40页 |
| 第一节 前言 | 第26页 |
| 第二节 材料和方法 | 第26-29页 |
| ·材料 | 第26-27页 |
| ·菌株和质粒 | 第26页 |
| ·主要试剂 | 第26页 |
| ·培养基及试剂配制 | 第26-27页 |
| ·主要仪器 | 第27页 |
| ·方法 | 第27-29页 |
| ·破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10总RNA的提取 | 第27页 |
| ·反转录 | 第27-28页 |
| ·△5-脂肪酸脱饱和酶基因第二链的合成 | 第28页 |
| ·PCR扩增产物的回收 | 第28页 |
| ·连接与转化 | 第28页 |
| ·菌落PCR验证 | 第28-29页 |
| ·序列测定与分析 | 第29页 |
| 第三节 结果与分析 | 第29-37页 |
| ·总RNA的提取和检测 | 第29页 |
| ·目的基因的扩增 | 第29-30页 |
| ·阳性克隆子的筛选与验证 | 第30-31页 |
| ·序列测定与同源性分析 | 第31-34页 |
| ·△5-脱饱和酶理化表征分析 | 第34页 |
| ·疏水分析和跨膜分析 | 第34-35页 |
| ·蛋白质的空间结构分析 | 第35-36页 |
| ·脱饱和酶的系统进化树分析 | 第36-37页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第37-40页 |
| 第二章 Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径△5-脱饱和酶基因在酿酒酵母中的表达 | 第40-48页 |
| 第一节 前言 | 第40页 |
| 第二节 材料和方法 | 第40-43页 |
| ·材料 | 第40-41页 |
| ·菌株和质粒 | 第40页 |
| ·主要试剂 | 第40-41页 |
| ·主要培养基及试剂配制 | 第41页 |
| ·主要仪器 | 第41页 |
| ·方法 | 第41-43页 |
| ·△5-脂肪酸脱饱和酶基因的扩增 | 第41页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第41-43页 |
| ·酿酒酵母感受态细胞的制备及转化 | 第43页 |
| ·酿酒酵母工程菌的诱导表达(参考本实验室(福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心)的标准实验方法) | 第43页 |
| ·重组表达产物的GC-MS分析 | 第43页 |
| 第三节 结果与分析 | 第43-47页 |
| ·目的基因DSR5的扩增 | 第43-44页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第44-45页 |
| ·重组酿酒酵母工程菌的构建 | 第45-46页 |
| ·酿酒酵母工程菌的诱导表达 | 第46-47页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第47-48页 |
| 第三章 Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径△5-脱饱和酶基因5′端侧翼序列的克隆和分析 | 第48-60页 |
| 第一节 前言 | 第48页 |
| 第二节 材料与方法 | 第48-50页 |
| ·材料 | 第48-49页 |
| ·菌株和质粒 | 第48页 |
| ·主要试剂及工具酶 | 第48页 |
| ·主要培养基及试剂配制 | 第48页 |
| ·主要仪器 | 第48-49页 |
| ·方法 | 第49-50页 |
| ·破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10基因组DNA的提取 | 第49页 |
| ·Thraustochytrium sp.FJN-10 △5-脂肪酸脱饱和酶基因5'端侧翼序列的克隆 | 第49-50页 |
| ·重组子的筛选和鉴定 | 第50页 |
| 第三节 结果与分析 | 第50-57页 |
| ·破囊壶菌△5-脱饱和酶基因5'端侧翼序列的LA-PCR扩增 | 第50-51页 |
| ·重组子的筛选及鉴定 | 第51页 |
| ·LA-PCR产物序列测定与序列分析 | 第51-53页 |
| ·启动子的验证和功能注释 | 第53-56页 |
| ·△5-脱饱和酶基因5'端侧翼序列的进化树分析 | 第56页 |
| ·不同物种△5-脱饱和酶基因启动子序列的转录元件比较分析 | 第56-57页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第57-60页 |
| 第四章 Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径△5-脱饱和酶基因5′端侧翼序列启动子功能验证 | 第60-66页 |
| 第一节 前言 | 第60页 |
| 第二节 材料与方法 | 第60-62页 |
| ·材料 | 第60-61页 |
| ·菌株和质粒 | 第60页 |
| ·主要培养基和试剂 | 第60-61页 |
| ·主要仪器 | 第61页 |
| ·方法 | 第61-62页 |
| ·海洋破囊壶菌△5-脱饱和酶基因5'端侧翼序列的亚克隆 | 第61页 |
| ·破囊壶菌△5-脱饱和酶基因5'端侧翼区与GFP报告基因融合表达载体的构建 | 第61-62页 |
| ·重组酵母工程菌的构建 | 第62页 |
| ·荧光显微观察鉴定 | 第62页 |
| 第三节 结果与分析 | 第62-65页 |
| ·海洋破囊壶菌△5-脱饱和酶基因5'端侧翼序列的亚克隆 | 第62-63页 |
| ·亚克隆序列的转化和验证 | 第63页 |
| ·重组酵母工程菌的转化和验证 | 第63-64页 |
| ·细胞荧光显微观察 | 第64-65页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第65-66页 |
| 第五章 Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径△5-脱饱和酶的定点突变 | 第66-76页 |
| 第一节 前言 | 第66页 |
| 第二节 材料和方法 | 第66-68页 |
| ·材料 | 第66-67页 |
| ·菌株和质粒 | 第66-67页 |
| ·主要试剂 | 第67页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第67页 |
| ·定点突变引物 | 第67页 |
| ·主要仪器 | 第67页 |
| ·方法 | 第67-68页 |
| ·定点突变PCR条件的摸索 | 第67-68页 |
| ·突变质粒的转化和验证 | 第68页 |
| ·突变质粒转化酿酒酵母构建重组工程菌 | 第68页 |
| 第三节 结果与分析 | 第68-73页 |
| ·海洋破囊壶菌△5-脱饱和酶基因重组质粒pYFAD5的提取 | 第68-69页 |
| ·海洋破囊壶菌△5-脱饱和酶基因pYFAD5的定点突变 | 第69页 |
| ·突变质粒的转化和验证 | 第69-70页 |
| ·突变质粒的测序和分析 | 第70-73页 |
| ·突变质粒重组酵母工程菌的构建 | 第73页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第73-76页 |
| 第六章 结论 | 第76-78页 |
| 附录 主要符号对照表 | 第78-80页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第80-82页 |
| 致谢 | 第82-84页 |
| 个人简历 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-89页 |
