| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 第一章 综述 | 第12-19页 |
| ·引言 | 第12页 |
| ·喜树碱及喜树资源简介 | 第12页 |
| ·喜树碱药源解决途径 | 第12-15页 |
| ·人工栽培 | 第12-13页 |
| ·化学合成 | 第13页 |
| ·内生真菌筛选 | 第13页 |
| ·喜树细胞培养 | 第13-15页 |
| ·喜树愈伤组织培养 | 第13页 |
| ·喜树细胞悬浮培养 | 第13-14页 |
| ·喜树细胞中喜树碱合成的代谢调控 | 第14-15页 |
| ·前体饲喂 | 第14页 |
| ·诱导子的添加 | 第14页 |
| ·催化酶的调节 | 第14-15页 |
| ·喜树碱代谢工程 | 第15-18页 |
| ·喜树的喜树碱生物合成途径 | 第15-16页 |
| ·喜树碱生物合成途径催化酶 | 第16-17页 |
| ·3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 合成酶 | 第16页 |
| ·香叶醇-10-脱氢酶 | 第16-17页 |
| ·异胡豆苷合成酶（Strictosidine synthase, STR） | 第17页 |
| ·ORCA3 在基因调控中的作用 | 第17页 |
| ·喜树遗传转化研究进展 | 第17页 |
| ·问题与展望 | 第17-18页 |
| ·本课题研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 材料与方法 | 第19-24页 |
| ·实验材料 | 第19-20页 |
| ·植物材料 | 第19页 |
| ·质粒及菌种 | 第19页 |
| ·主要仪器设备 | 第19页 |
| ·购买的试剂、酶及药品等 | 第19-20页 |
| ·常用试剂 | 第20页 |
| ·实验方法 | 第20-24页 |
| ·喜树无菌苗的获得 | 第20页 |
| ·喜树HMGS 基因的克隆 | 第20-22页 |
| ·喜树RNA 的提取与检测 | 第20-21页 |
| ·准备工作 | 第20页 |
| ·TRIzol 法抽提喜树RNA | 第20页 |
| ·检测RNA 的质量与纯度 | 第20-21页 |
| ·3’RACE | 第21页 |
| ·喜树第一链cDNA 的合成 | 第21页 |
| ·3’端cDNA 片段扩增 | 第21页 |
| ·5’RACE | 第21-22页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第21页 |
| ·5’端cDNA 片段扩增 | 第21-22页 |
| ·CaHMGS ORF 的扩增. | 第22页 |
| ·凝胶电泳条带或酶切产物的柱层析纯化回收 | 第22页 |
| ·DNA 回收片段与pMD18-T easy vector(Takara)载体的连接 | 第22页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl_2 法) | 第22页 |
| ·DNA 与pMD18-T easy Vector 的连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第22页 |
| ·阳性克隆的筛选及测序鉴定 | 第22页 |
| ·CaHMGS 在喜树根、子叶和胚轴的RT-PCR 分析 | 第22页 |
| ·RNA 的提取 | 第22页 |
| ·RT-PCR | 第22页 |
| ·MJ 和SA 对CaHMGS 在喜树中表达影响的RT-PCR 分析 | 第22-23页 |
| ·甲基茉莉酸对喜树植株的诱导处理 | 第23页 |
| ·RT-PCR | 第23页 |
| ·喜树毛状根的获得与条件优化 | 第23-24页 |
| ·喜树无菌苗的获得（同2.2.1） | 第23页 |
| ·发根农杆菌C58C1 的保存和活化 | 第23页 |
| ·外植体预培养 | 第23页 |
| ·农杆菌与外植体的共培养 | 第23页 |
| ·毛状根的诱导和培养 | 第23-24页 |
| 第三章 结果与分析 | 第24-39页 |
| ·总RNA 的提取 | 第24页 |
| ·喜树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 合成酶(CaHMGS)的克隆 | 第24-31页 |
| ·3'RACE | 第24页 |
| ·5'RACE | 第24-28页 |
| ·分子进化分析 | 第28-29页 |
| ·CaHMGS 的表达部位特异性分析 | 第29-30页 |
| ·水杨酸和甲基茉莉酸CaHMGS 的影响 | 第30-31页 |
| ·喜树毛状根的诱导及其喜树碱的产生 | 第31-35页 |
| ·喜树毛状根的诱导及形态学特征 | 第31-32页 |
| ·喜树毛状根中rolB 基因的PCR 鉴定 | 第32页 |
| ·不同外植体类型对喜树毛状根诱导率的影响 | 第32-33页 |
| ·胚轴不同年龄段和不同发根菌株对喜树毛状根诱导率的影响 | 第33-34页 |
| ·不同农杆菌诱导的毛状根中喜树碱的HPLC 检测 | 第34-35页 |
| ·不同菌株诱导的毛状根中喜树碱和羟基喜树碱的含量比较 | 第35页 |
| ·带基因的喜树毛状根喜树碱含量的测定 | 第35-39页 |
| ·转基因喜树毛状根的分子鉴定 | 第35-36页 |
| ·喜树毛状根喜树碱含量的高效液相色谱(HPLC)方法的建立 | 第36-37页 |
| ·检测波长的确定 | 第36页 |
| ·流动相的选择 | 第36-37页 |
| ·精密度试验 | 第37页 |
| ·重复性试验 | 第37页 |
| ·稳定性试验 | 第37页 |
| ·标准曲线的制作 | 第37页 |
| ·单转 ORCA3 基因喜树毛状根喜树碱含量 | 第37页 |
| ·单转 G10H 基因喜树毛状根喜树碱含量 | 第37-38页 |
| ·共转 G10H+STR 基因喜树毛状根喜树碱含量 | 第38-39页 |
| 第四章 总结 | 第39-42页 |
| ·喜树 HMGS 基因克隆小结 | 第39页 |
| ·喜树遗传转化存在的问题 | 第39页 |
| ·影响发根诱导的因素 | 第39-40页 |
| ·喜树碱代谢工程研究 | 第40页 |
| ·成功地将 ORCA3, G10H 和 G10H+STR 基因转到喜树毛状根中 | 第40页 |
| ·本论文的主要创新点 | 第40-41页 |
| ·后续研究方向 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-49页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第49-50页 |
| 致谢 | 第50页 |
