| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-32页 |
| 1 双生病毒概述 | 第15-19页 |
| ·双生病毒的分类与基因组结构 | 第15-16页 |
| ·双生病毒的传播介体与传度相关蛋白 | 第16-17页 |
| ·双生病毒的危害及在中国的现状 | 第17-19页 |
| ·双生病毒的危害 | 第17-18页 |
| ·双生病毒在中国的现状 | 第18-19页 |
| 2 RNA沉默概述 | 第19-30页 |
| ·RNA沉默的现象和定义 | 第19-21页 |
| ·植物中的共抑制或转录后基因沉默 | 第20-21页 |
| ·真菌中的基因压制或消除作用 | 第21页 |
| ·RNA干扰(RNA interference,RNAi) | 第21页 |
| ·RNA沉默的机制 | 第21-25页 |
| ·dsRNA的产生 | 第22-23页 |
| ·Dicer蛋白酶与siRNA的形成 | 第23-24页 |
| ·RdRP与siRNA的扩增 | 第24-25页 |
| ·mRNA的降解 | 第25页 |
| ·RNA沉默的应用 | 第25-30页 |
| ·在功能基因组研究方面的应用 | 第25-27页 |
| ·在植物病毒病防治中的应用 | 第27-29页 |
| ·在疾病治疗上的应用 | 第29页 |
| ·RNA沉默在作物品质改良中的应用 | 第29-30页 |
| 3 本研究的目的与意义 | 第30-32页 |
| 第二章 中国番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白片段dsRNA介导的抗病性研究 | 第32-79页 |
| 1 材料与方法 | 第32-53页 |
| ·材料 | 第32-34页 |
| ·病毒毒源 | 第32页 |
| ·供试植物 | 第32页 |
| ·菌种、质粒、试剂 | 第32页 |
| ·培养基 | 第32-33页 |
| ·引物 | 第33-34页 |
| ·方法 | 第34-53页 |
| ·pBIN19植物表达载体的改造 | 第34页 |
| ·TYLCCNV外壳蛋白不同同源性基因片段的选取 | 第34页 |
| ·TYLCCNV外壳蛋白不同长度基因片段的选取 | 第34-35页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第35页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第35-36页 |
| ·DNA的割胶回收 | 第36-37页 |
| ·DNA的酶切 | 第37页 |
| ·DNA片段的连接 | 第37-38页 |
| ·大肠杆菌NM522感受态细胞的制备方法 | 第38-39页 |
| ·连接产物的转化 | 第39-40页 |
| ·带有TYLCCNV CP反向重复结构系列植物表达载体的构建 | 第40页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第40-43页 |
| ·电泳 | 第43-44页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第44页 |
| ·重组植物表达载体的农杆菌转化 | 第44-45页 |
| ·农杆菌介导的外源基因向烟草中转化及转化植株的获得 | 第45-46页 |
| ·转化烟草的卡那霉素抗性筛选鉴定及扩繁 | 第46页 |
| ·农杆菌介导的外源基因向番茄中转化及转化植株的获得 | 第46-48页 |
| ·转化植株的DNA提取及PCR检测 | 第48-49页 |
| ·转基因植物的Southern blot分析 | 第49-51页 |
| ·农杆菌介导的植株接种 | 第51-52页 |
| ·转基因植株总RNA的提取及Northern blot分析 | 第52-53页 |
| 2 结果与分析 | 第53-76页 |
| ·pBIN19载体的改造 | 第53-56页 |
| ·含TYLCCNV CP片段系列植物表达载体的构建 | 第56-65页 |
| ·系列TYLCCNV CP片段的获得 | 第56-59页 |
| ·含TYLCCNV CP片段系列植物表达载体的构建 | 第59-65页 |
| ·含TYLCCNV CP片段系列植物表达载体的农杆菌转化 | 第65-66页 |
| ·未转化植物的选择压力的确定 | 第66-67页 |
| ·农杆菌介导的遗传转化 | 第67-69页 |
| ·本氏烟的遗传转化 | 第67-68页 |
| ·番茄Moneymaker的遗传转化 | 第68-69页 |
| ·转基因植株PCR鉴定 | 第69-71页 |
| ·转化植株的总DNA提取 | 第69-70页 |
| ·转化烟草和番茄植株的PCR筛选 | 第70-71页 |
| ·TO代转基因植株的无性扩繁 | 第71-72页 |
| ·TO代转基因烟草扩繁株的攻毒实验和抗病性分析 | 第72-73页 |
| ·转基因的Southern blot分析 | 第73-75页 |
| ·转基因烟草的Southern blot分析 | 第73-74页 |
| ·转基因番茄的Southern blot分析 | 第74-75页 |
| ·转基因烟草T1代攻毒实验和抗病性分析 | 第75-76页 |
| ·转基因番茄T1代攻毒实验和抗病性分析 | 第76页 |
| ·转基因烟草的Northern blot分析 | 第76页 |
| 3 讨论 | 第76-78页 |
| 4 结论 | 第78-79页 |
| 第三章 B型烟粉虱内共生菌传毒相关蛋白GroEL基因片段dsRNA介导的抗病性研究 | 第79-95页 |
| 1 材料与方法 | 第79-81页 |
| ·材料 | 第79-80页 |
| ·烟粉虱 | 第79页 |
| ·毒源、供试植物、菌种、质粒、试剂 | 第79页 |
| ·引物 | 第79-80页 |
| ·方法 | 第80-81页 |
| ·GroEL基因的克隆 | 第80页 |
| ·502bp GroEL基因正向片段G502F和反向片段G502R的获得 | 第80-81页 |
| ·306bp GroEL基因正向片段G306F和反向片段G306R的获得 | 第81页 |
| ·含B型烟粉虱GroEL基因片段反向重复结构系列植物表达载体的构建 | 第81页 |
| ·B型烟粉虱传毒体系的建立 | 第81页 |
| 2 结果与分析 | 第81-93页 |
| ·GroEL基因的克隆 | 第81-82页 |
| ·B型烟粉虱总DNA的提取 | 第81-82页 |
| ·GroEL基因的克隆 | 第82页 |
| ·含GroEL基因片段一系列植物表达载体的构建 | 第82-87页 |
| ·一系列GroEL基因片段的获得 | 第82-83页 |
| ·含GroEL基因片段一系列植物表达载体的构建 | 第83-87页 |
| ·含GroEL片段的一系列植物表达载体的农杆菌转化 | 第87-88页 |
| ·未转化植物的选择压力的确定 | 第88页 |
| ·烟草和番茄的遗传转化 | 第88页 |
| ·转基因植株PCR鉴定 | 第88-90页 |
| ·转化植株的总DNA提取 | 第88页 |
| ·转化烟草和番茄植株的PCR鉴定 | 第88-90页 |
| ·T0代转基因植株的无性扩繁 | 第90页 |
| ·利用农杆菌介导的植株接种对TO代转基因烟草扩繁株的攻毒实验和抗病性分析 | 第90-91页 |
| ·利用B型烟粉虱传毒体系对TO代转基因烟草扩繁株进行攻毒实验和抗病性分析 | 第91页 |
| ·TO代转基因烟草扩繁株对B型烟粉虱传毒能力的干扰分析 | 第91-92页 |
| ·转基因烟草的Southern blot分析 | 第92-93页 |
| ·转基因烟草的Northern blot分析 | 第93页 |
| 3 讨论 | 第93-94页 |
| 4 结论 | 第94-95页 |
| 第四章 在烟草中瞬时表达TYLCCNV CP基因dsRNA的抗病性初步分析 | 第95-103页 |
| 1 材料和方法 | 第95-98页 |
| ·材料 | 第95页 |
| ·载体 | 第95页 |
| ·供试植物 | 第95页 |
| ·菌株、试剂和毒源 | 第95页 |
| ·方法 | 第95-98页 |
| ·用于瞬时表达的系列植物表达载体的构建 | 第95-97页 |
| ·植物表达载体转化农杆菌 | 第97页 |
| ·农杆菌介导的瞬时表达 | 第97页 |
| ·渗入实验和攻毒实验 | 第97页 |
| ·TYLCCNV农杆菌侵染性克隆接种后病毒的PCR检测 | 第97-98页 |
| ·GFP荧光检测 | 第98页 |
| 2 结果与分析 | 第98-101页 |
| ·用于瞬时表达的系列植物表达载体的构建 | 第98-100页 |
| ·含GFP的植物表达载体的构建 | 第98-99页 |
| ·含GFP与TYLCCNV CP全序列植物表达载体的构建 | 第99-100页 |
| ·含CP片段反向重复dsRNA植物表达载体的构建 | 第100页 |
| ·用于瞬时表达的系列植物表达载体的农杆菌转化 | 第100页 |
| ·含TYLCCNV CP片段的dsRNA载体干扰GFP的表达 | 第100-101页 |
| ·TYLCCNV CP片段的dsRNA基因瞬时表达烟草抑制TYLCCNV的表达 | 第101页 |
| ·基因瞬时表达的Northern blot分析 | 第101页 |
| 3 讨论 | 第101-102页 |
| 4 结论 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-117页 |
| 附录A 本论文所用重要缩写词及中文对照 | 第117-119页 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 | 第119-124页 |
| 附录C 常用的抗生素及使用浓度 | 第124-125页 |
| 附录D 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 | 第125-127页 |
| 致谢 | 第127-129页 |
| 作者简介 | 第129页 |
