| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第一章 引言 | 第16-29页 |
| 1.1 多粘菌素的结构 | 第16页 |
| 1.2 多粘菌素的抗菌机制 | 第16-17页 |
| 1.3 多粘菌素的耐药机制 | 第17-19页 |
| 1.4 mcr-1基因的发现 | 第19-20页 |
| 1.5 mcr-1的耐药机制 | 第20页 |
| 1.6 mcr-1基因的溯源 | 第20-21页 |
| 1.7 mcr-1的流行现状 | 第21-26页 |
| 1.7.1 mcr-1在人源细菌中的流行现状 | 第22-23页 |
| 1.7.2 mcr-1在动物源细菌中的流行现状 | 第23-25页 |
| 1.7.3 mcr-1在食品、环境和野生动物中的流行现状 | 第25-26页 |
| 1.8 mcr-1基因的变异 | 第26页 |
| 1.9 mcr-1的传播机制 | 第26-28页 |
| 1.10 研究的目的与意义 | 第28-29页 |
| 第二章 动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因的流行病学研究 | 第29-46页 |
| 2.1 材料 | 第29-31页 |
| 2.1.1 试验菌株 | 第29页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第29页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第29-30页 |
| 2.1.4 细菌培养基与试剂的配制 | 第30-31页 |
| 2.1.4.1 培养基的配制 | 第30页 |
| 2.1.4.2 试剂的配制 | 第30-31页 |
| 2.2 方法 | 第31-39页 |
| 2.2.1 样本的采集 | 第31-32页 |
| 2.2.2 大肠杆菌的分离与初步鉴定 | 第32页 |
| 2.2.3 大肠杆菌属和mcr-1基因的PCR检测 | 第32-34页 |
| 2.2.3.1 PCR模板的制备 | 第32-33页 |
| 2.2.3.2 引物的合成 | 第33页 |
| 2.2.3.3 16S rRNA扩增片段回收测序 | 第33-34页 |
| 2.2.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定 | 第34-35页 |
| 2.2.4.1 微量肉汤稀释法 | 第34页 |
| 2.2.4.2 磷霉素MIC值测定采用微量琼脂稀释法 | 第34-35页 |
| 2.2.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型 | 第35-38页 |
| 2.2.5.1 胶块的制备 | 第35-36页 |
| 2.2.5.2 细胞裂解 | 第36页 |
| 2.2.5.3 洗涤 | 第36页 |
| 2.2.5.4 预酶切 | 第36-37页 |
| 2.2.5.5 酶切 | 第37页 |
| 2.2.5.6 电泳 | 第37-38页 |
| 2.2.5.7 染色、脱色、拍照及图片保存 | 第38页 |
| 2.2.6 大肠杆菌的多位点序列分型(MLST) | 第38-39页 |
| 2.2.6.1 PCR引物的合成 | 第38-39页 |
| 2.2.6.2 mcr-1阳性大肠杆菌基因组DNA的提取 | 第39页 |
| 2.2.6.3 PCR扩增 | 第39页 |
| 2.2.6.4 PCR产物回收和测序 | 第39页 |
| 2.3 结果 | 第39-43页 |
| 2.3.1 动物源mcr-1阳性大肠杆菌的分离情况 | 第39-40页 |
| 2.3.2 mcr-1阳性分离菌耐药性情况 | 第40-41页 |
| 2.3.3 PFGE分型结果 | 第41-43页 |
| 2.3.4 MLST分型结果 | 第43页 |
| 2.4 讨论 | 第43-45页 |
| 2.5 小结 | 第45-46页 |
| 第三章 mcr-1基因定位与可转移性分析 | 第46-66页 |
| 3.1 材料 | 第46-48页 |
| 3.1.1 菌株 | 第46页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第46页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第46-47页 |
| 3.1.4 试剂的配制 | 第47-48页 |
| 3.2 方法 | 第48-59页 |
| 3.2.1 S1-PFGE | 第48-50页 |
| 3.2.1.1 胶块的制备 | 第48-49页 |
| 3.2.1.2 裂解菌体 | 第49页 |
| 3.2.1.3 洗涤胶块 | 第49-50页 |
| 3.2.1.4 酶切 | 第50页 |
| 3.2.1.5 电泳 | 第50页 |
| 3.2.1.6 凝胶染色、拍照及图片保存 | 第50页 |
| 3.2.2 Southern blot | 第50-54页 |
| 3.2.2.1 DNA探针的制备 | 第51页 |
| 3.2.2.2 DNA和地高辛结合效率的检测 | 第51-52页 |
| 3.2.2.3 DNA的转移和固定 | 第52-53页 |
| 3.2.2.4 杂交 | 第53-54页 |
| 3.2.2.5 检测 | 第54页 |
| 3.2.3 接合转移试验 | 第54-55页 |
| 3.2.4 接合子/电转化子质粒复制型鉴定 | 第55-56页 |
| 3.2.4.1 引物合成 | 第55-56页 |
| 3.2.4.2 PCR反应条件 | 第56页 |
| 3.2.5 接合转移频率的测定 | 第56-57页 |
| 3.2.6 野生菌质粒电击转化大肠杆菌DH5α | 第57-59页 |
| 3.2.6.1 大肠杆菌DH5α电转感受态细胞的制备 | 第57页 |
| 3.2.6.2 大肠杆菌质粒的提取 | 第57-58页 |
| 3.2.6.3 电击转化 | 第58-59页 |
| 3.2.7 接合子/电转化子MIC值的测定 | 第59页 |
| 3.2.8 质粒稳定性试验 | 第59页 |
| 3.2.9 生长动力学曲线的测定 | 第59页 |
| 3.3 结果 | 第59-64页 |
| 3.3.1 mcr-1基因定位结果 | 第59-60页 |
| 3.3.2 接合转移试验结果 | 第60-63页 |
| 3.3.3 三株mcr-1阳性质粒电转化结果 | 第63页 |
| 3.3.4 接合子/电转化子药敏试验结果 | 第63页 |
| 3.3.5 质粒稳定性试验和生长动力学曲线测定结果 | 第63-64页 |
| 3.4 讨论 | 第64-65页 |
| 3.5 小结 | 第65-66页 |
| 第四章 mcr-1在动物源大肠杆菌中的传播机制研究 | 第66-84页 |
| 4.1 材料 | 第66-67页 |
| 4.1.1 菌株 | 第66页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第66页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第66-67页 |
| 4.2 方法 | 第67-70页 |
| 4.2.1 菌株基因组草图以及质粒的全基因组测序 | 第67页 |
| 4.2.1.1 基因组和质粒的提取 | 第67页 |
| 4.2.1.2 二代和三代测序 | 第67页 |
| 4.2.2 生物信息学分析 | 第67页 |
| 4.2.3 mcr-1基因突变体的功能检测 | 第67-70页 |
| 4.2.3.1 引物设计 | 第67-68页 |
| 4.2.3.2 mcr-1cassette的扩增 | 第68页 |
| 4.2.3.3 PCR产物鉴定与纯化 | 第68页 |
| 4.2.3.4 目的基因和载体质粒的酶切 | 第68页 |
| 4.2.3.5 酶切产物的胶回收 | 第68页 |
| 4.2.3.6 载体和目的基因的连接 | 第68-69页 |
| 4.2.3.7 重组质粒转化 | 第69页 |
| 4.2.3.8 重组质粒的鉴定 | 第69页 |
| 4.2.3.9 重组菌多粘菌素MIC值的测定 | 第69-70页 |
| 4.3 结果 | 第70-81页 |
| 4.3.1 mcr-1阳性质粒的结构与序列分析 | 第70-76页 |
| 4.3.1.1 mcr-1阳性IncP型质粒结构与序列分析 | 第70-71页 |
| 4.3.1.2 mcr-1阳性IncX4型质粒结构与序列分析 | 第71-72页 |
| 4.3.1.3 mcr-1阳性IncHI2型质粒结构与序列分析 | 第72-73页 |
| 4.3.1.4 mcr-1阳性IncI2型质粒结构与序列分析 | 第73-74页 |
| 4.3.1.5 mcr-1阳性IncY型质粒结构与序列分析 | 第74-76页 |
| 4.3.2 mcr-1阳性毒力—耐药杂合质粒的鉴定与进化分析 | 第76-78页 |
| 4.3.2.1 mcr-1阳性毒力—耐药杂合质粒序列比对分析 | 第76-77页 |
| 4.3.2.2 质粒融合机制的预测 | 第77-78页 |
| 4.3.3 mcr-1基因环境分析 | 第78页 |
| 4.3.4 mcr-1基因突变体的功能检测 | 第78-81页 |
| 4.4 讨论 | 第81-83页 |
| 4.4.1 mcr-1阳性质粒的特点 | 第81-82页 |
| 4.4.2 mcr-1阳性毒力—耐药质粒的进化分析 | 第82-83页 |
| 4.4.3 mcr-1基因环境分析 | 第83页 |
| 4.4.4 mcr-1基因突变体功能检测 | 第83页 |
| 4.5 小结 | 第83-84页 |
| 第五章 全文结论 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 作者简历 | 第97页 |
