| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第10-18页 |
| 1.1 天然橡胶的发展现状 | 第10-11页 |
| 1.2 植物中/碱性转化酶的研究进展 | 第11-13页 |
| 1.2.1 N/A-Inv对植物生长和胁迫应答的重要性 | 第11页 |
| 1.2.2 蛋白互作与磷酸化是N/A-Inv酶学调控的重要方式 | 第11-12页 |
| 1.2.3 橡胶树胶乳转化酶属于N/A-Inv,其活性调控与橡胶产量密切相关 | 第12-13页 |
| 1.3 14-3-3蛋白的研究进展 | 第13-15页 |
| 1.3.1 植物中的14-3-3蛋白 | 第13-14页 |
| 1.3.2 14-3-3蛋白的调控作用和蔗糖代谢的关系 | 第14-15页 |
| 1.4 磷脂酰肌醇磷酸肌酶的研究进展 | 第15页 |
| 1.5 本研究的目的与意义 | 第15-17页 |
| 1.6 本研究的技术路线 | 第17-18页 |
| 2 材料与方法 | 第18-43页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第18-19页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第18页 |
| 2.1.2 质粒与菌种 | 第18页 |
| 2.1.3 酶与生化试剂 | 第18页 |
| 2.1.4 主要实验设备 | 第18-19页 |
| 2.2 方法与步骤 | 第19-43页 |
| 2.2.1 巴西橡胶树不同组织RNA的提取 | 第19-20页 |
| 2.2.2 提取RNA的检测 | 第20-21页 |
| 2.2.3 RNA中DNA的消化 | 第21页 |
| 2.2.4 逆转录合成第一链cDNA | 第21-22页 |
| 2.2.5 胶乳均一化cDNA文库构建 | 第22-25页 |
| 2.2.6 HbNIN2互作蛋白的筛选 | 第25-27页 |
| 2.2.7 巴西橡胶树14-3-3蛋白家族基因的克隆 | 第27-30页 |
| 2.2.8 橡胶树转化酶基因HbNIN5和HbNIN8全长cDNA的克隆 | 第30-31页 |
| 2.2.9 橡胶树磷脂酰肌醇磷酸肌酶全长cDNA的克隆 | 第31页 |
| 2.2.10 酵母双杂交载体构建 | 第31-34页 |
| 2.2.11 酵母双杂交验证蛋白互作 | 第34-36页 |
| 2.2.12 橡胶树14-3-3蛋白与转化酶蛋白基因双分子荧光互补验证 | 第36-37页 |
| 2.2.13 橡胶树14-3-3蛋白与HbNIN2蛋白基因原核表达载体构建 | 第37-38页 |
| 2.2.14 原核表达14-3-3与HbNIN2蛋白 | 第38-39页 |
| 2.2.15 亲和层析纯化原核表达的14-3-3与HbNIN2蛋白 | 第39页 |
| 2.2.16 原核表达14-3-3对HbNIN2蛋白活性的影响 | 第39页 |
| 2.2.17 真核表达HbNIN2蛋白 | 第39-42页 |
| 2.2.18 14-3-3蛋白对真核表达HbNIN2蛋白活性的影响 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-63页 |
| 3.1 橡胶树不同组织RNA提取与检测 | 第43页 |
| 3.1.1 胶乳RNA提取与检测 | 第43页 |
| 3.1.2 其他组织RNA提取与检测 | 第43页 |
| 3.2 胶乳均一化cDNA文库构建 | 第43-45页 |
| 3.2.1 cDNA的合成与分析 | 第43-44页 |
| 3.2.2 cDNA均一化处理 | 第44页 |
| 3.2.3 cDNA均一化文库构建与检测 | 第44-45页 |
| 3.3 HbNIN2互作蛋白的筛选 | 第45-47页 |
| 3.3.1 阳性互作蓝白斑筛选 | 第45页 |
| 3.3.2 候选阳性互作蛋白菌落PCR检测 | 第45页 |
| 3.3.3 候选阳性质粒酵母回转验证 | 第45-46页 |
| 3.3.4 阳性互作蛋白的分析 | 第46-47页 |
| 3.4 橡胶树中/碱性转化酶候选互作蛋白家族基因的克隆 | 第47-51页 |
| 3.4.1 橡胶树14-3-3蛋白全长基因克隆与分析 | 第47-50页 |
| 3.4.2 橡胶树磷脂酰肌醇磷酸肌酶全长基因克隆与分析 | 第50页 |
| 3.4.3 橡胶树两个转化酶全长基因的克隆 | 第50-51页 |
| 3.5 酵母双杂交载体构建 | 第51-55页 |
| 3.5.1 橡胶树转化酶蛋白酵母诱饵表达载体构建 | 第51页 |
| 3.5.2 橡胶树14-3-3蛋白酵母猎物表达载体构建 | 第51页 |
| 3.5.3 橡胶树磷脂酰肌醇磷酸肌酶基因酵母猎物表达载体构建 | 第51-52页 |
| 3.5.4 酵母诱饵表达载体毒性检测 | 第52页 |
| 3.5.5 酵母诱饵表达载体自激活验证 | 第52-53页 |
| 3.5.6 14-3-3蛋白与转化酶酵母双杂交结果分析 | 第53-54页 |
| 3.5.7 磷脂酰肌醇磷酸肌酶与转化酶酵母双杂交结果分析 | 第54-55页 |
| 3.6 双分子荧光互补载体构建 | 第55-56页 |
| 3.6.1 pSYCE-HbGF14s载体构建 | 第55页 |
| 3.6.2 pSYNE-HbNIN2载体质粒双酶切鉴定 | 第55-56页 |
| 3.7 HbGF14s和HbNIN2的原核表达及互作调控分析 | 第56-59页 |
| 3.7.1 HbGF14s原核表达载体pET32a-HbGF14s构建 | 第56页 |
| 3.7.2 原核表达HbGF14蛋白SDS-PAGE检测 | 第56-57页 |
| 3.7.3 亲和层析纯化HbGF14和HbNIN2蛋白SDS-PAGE检测 | 第57-58页 |
| 3.7.4 14-3-3蛋白与HbNIN2蛋白共孵育酶活测定 | 第58-59页 |
| 3.8 HbNIN2蛋白的酵母表达及互作调控 | 第59-63页 |
| 3.8.1 Western Blot与SDS-PAGE对比检测结果 | 第59-60页 |
| 3.8.2 饱和硫酸铵沉淀HbNIN2蛋白 | 第60-61页 |
| 3.8.3 真核表达HbNIN2与纯化14-3-3蛋白共孵育酶活测定 | 第61-63页 |
| 4 讨论与结论 | 第63-66页 |
| 4.1 讨论 | 第63-65页 |
| 4.2 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-73页 |
| 缩略词 | 第73-74页 |
| 附录 | 第74-76页 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 | 第76-77页 |
| 资助项目 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
