| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 1 引言 | 第12-21页 |
| 1.1 谷氨酸棒杆菌简介 | 第12页 |
| 1.1.1 谷氨酸棒杆菌的工业应用 | 第12页 |
| 1.1.2 谷氨酸棒杆菌的基因工程改造 | 第12页 |
| 1.2 限制修饰系统简介 | 第12-17页 |
| 1.2.1 Ⅰ型限制修饰系统 | 第13页 |
| 1.2.2 Ⅱ型限制修饰系统 | 第13-15页 |
| 1.2.3 Ⅲ型限制修饰系统 | 第15页 |
| 1.2.4 Ⅳ型限制修饰系统 | 第15-16页 |
| 1.2.5 解旋酶 | 第16页 |
| 1.2.6 谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC132032中的限制修饰系统 | 第16-17页 |
| 1.3 谷氨酸棒杆菌的DNA转化方法及转化效率 | 第17-18页 |
| 1.3.1 原生质体转化法和转导 | 第17-18页 |
| 1.3.2 接合转移 | 第18页 |
| 1.3.3 电转化 | 第18页 |
| 1.4 严谨控制型表达载体及其在极毒蛋白表达中的应用 | 第18-20页 |
| 1.5 主要研究内容和意义 | 第20-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-35页 |
| 2.1 试验材料 | 第21-25页 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 | 第21-23页 |
| 2.1.2 主要培养基及试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.3 主要试验仪器 | 第24-25页 |
| 2.2 试验方法 | 第25-30页 |
| 2.2.1 细菌基因组的制备 | 第25页 |
| 2.2.2 质粒DNA的制备 | 第25-26页 |
| 2.2.3 PCR反应体系 | 第26页 |
| 2.2.4 质粒和PCR产物的酶切、纯化和连接 | 第26页 |
| 2.2.5 E.coli化学转化法感受态细胞的制备和连接产物的转化 | 第26-27页 |
| 2.2.6 谷氨酸棒杆菌电转化感受态细胞的制备和质粒的电转化 | 第27-28页 |
| 2.2.7 E.coli电转化感受态细胞的制备与基因的同源重组 | 第28页 |
| 2.2.8 重组质粒的DNA测序 | 第28页 |
| 2.2.9 蛋白质SDS-PAGE和WesternBlot印迹分析 | 第28-30页 |
| 2.3 菌种保藏 | 第30页 |
| 2.4 构建染色体整合甲基化酶编码基因的E.coli工程菌株AU1 | 第30-32页 |
| 2.4.1 构建重组质粒pACYC184-M.cglI | 第30页 |
| 2.4.2 验证M.cglI基因的甲基化功能 | 第30-31页 |
| 2.4.3 构建重组质粒pAU4-Larm-M.cglI-cat-Rarm | 第31页 |
| 2.4.4 M.cglI基因的E.coliTG1染色体整合 | 第31页 |
| 2.4.5 谷氨酸棒杆菌转化率的验证 | 第31-32页 |
| 2.5 表达极毒蛋白的严谨控制型表达载体的构建 | 第32页 |
| 2.5.1构建表达载体pAU10 | 第32页 |
| 2.5.2 验证pAU10表达载体的可用性 | 第32页 |
| 2.6 R.cglI蛋白在E.coli中的表达及纯化 | 第32-33页 |
| 2.6.1 构建重组质粒pAU10-R.cglI | 第32-33页 |
| 2.6.2 R.cglI蛋白的诱导表达 | 第33页 |
| 2.6.3 R.cglI蛋白的初步纯化 | 第33页 |
| 2.7 H.cglI蛋白在E.coli中的表达及其可替代性验证 | 第33-35页 |
| 2.7.1 E.coliTG1/pACYC184-M.cglI感受态细胞的制备 | 第33页 |
| 2.7.2 构建重组质粒pAU4-R.cglI | 第33-34页 |
| 2.7.3 重组质粒pACYC184-M.cglI和pAU4-R.cglI共转化 | 第34页 |
| 2.7.4 构建重组质粒pET-28a-H.cglI | 第34页 |
| 2.7.5 H.cglI蛋白的诱导表达 | 第34页 |
| 2.7.6 H.cglI蛋白的初步纯化 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-59页 |
| 3.1 染色体上整合甲基化酶编码基因M.cglI的E.coli工程菌株AU1的构建 | 第35-43页 |
| 3.1.1 重组质粒pACYC184-M.cglI的构建 | 第35-36页 |
| 3.1.2 M.cglI基因的甲基化功能验证 | 第36页 |
| 3.1.3 重组质粒pAU4-Larm构建 | 第36-38页 |
| 3.1.4 重组质粒pAU4-Larm-Rarm的构建 | 第38-39页 |
| 3.1.5 重组质粒pAU4-Larm-cat-Rarm的构建 | 第39-40页 |
| 3.1.6 重组质粒pAU4-Larm-M.cglI-cat-Rarm的构建 | 第40-41页 |
| 3.1.7 基于同源重组的M.cglI基因的E.coliTG1染色体整合 | 第41-42页 |
| 3.1.8 不同来源质粒DNA对谷氨酸棒杆菌转化率的影响 | 第42-43页 |
| 3.2 表达极毒蛋白的严谨控制型表达载体的构建 | 第43-51页 |
| 3.2.1 pAU7载体的构建 | 第43-45页 |
| 3.2.2 pAU8载体的构建 | 第45-46页 |
| 3.2.3 pAU9载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.2.4 pAU10表达载体的构建 | 第47-50页 |
| 3.2.5 重组质粒pAU10-bamHI的构建 | 第50-51页 |
| 3.2.6 BamHI蛋白的表达 | 第51页 |
| 3.3 R.cglI蛋白在E.coli中的表达及纯化 | 第51-54页 |
| 3.3.1 重组质粒pAU10-R.cglI的构建 | 第51-52页 |
| 3.3.2 R.cglI蛋白在E.coli中的表达 | 第52-54页 |
| 3.3.3 R.cglI蛋白的粗分离 | 第54页 |
| 3.4 H.cglI蛋白在E.coli中的表达以及可替代性验证 | 第54-59页 |
| 3.4.1 重组质粒pAU4-R.cglI的构建 | 第54-55页 |
| 3.4.2 重组质粒pACYC184-M.cglI和pAU4-R.cglI共转化实验 | 第55-56页 |
| 3.4.3 重组质粒pET-28a-H.cglI构建 | 第56页 |
| 3.4.4 H.cglI蛋白的诱导表达 | 第56-57页 |
| 3.4.5 H.cglI蛋白的纯化 | 第57-59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 5 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 硕士期间发表文章 | 第68-69页 |
| 作者简历 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 详细摘要 | 第71-72页 |
