| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略表 | 第14-17页 |
| 实验仪器与设备 | 第17-20页 |
| 实验试剂 | 第20-24页 |
| 第一章 前言 | 第24-33页 |
| 1.1 黑色素瘤及其治疗 | 第24-25页 |
| 1.2 SLPI蛋白 | 第25-27页 |
| 1.2.1 SLPI蛋白简介 | 第25页 |
| 1.2.2 SLPI蛋白与肿瘤 | 第25-27页 |
| 1.3 MAPK信号通路 | 第27-28页 |
| 1.3.1 MAPK信号通路简介 | 第27-28页 |
| 1.3.2 MAPK信号通路与肿瘤 | 第28页 |
| 1.4 基质金属蛋白酶(MMPs) | 第28-30页 |
| 1.4.1 金属基质蛋白酶简介 | 第28-29页 |
| 1.4.2 金属基质蛋白酶与肿瘤 | 第29-30页 |
| 1.5 研究意义 | 第30-31页 |
| 1.6 实验方案设计 | 第31-33页 |
| 第二章 SLPI基因过表达体系及SLPI基因沉默体系的构建 | 第33-54页 |
| 2.1 实验材料 | 第33-35页 |
| 2.1.1 载体、菌株 | 第33页 |
| 2.1.2 主要试剂配制 | 第33-35页 |
| 2.2 SLPI基因过表达体系的构建 | 第35-47页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第35-36页 |
| 2.2.2 人源SLPI基因的获得 | 第36-37页 |
| 2.2.3 PCR产物鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.4 PCR产物纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.5 pCMV6-HomoSLPI-GFP及pLVX-IRES-ZsGreen1质粒提取 | 第39-41页 |
| 2.2.6 SLPI片段与pLVX-IRES-ZsGreen1质粒双酶切 | 第41-42页 |
| 2.2.7 双酶切产物胶回收 | 第42-43页 |
| 2.2.8 SLPI片段与线性载体连接 | 第43-44页 |
| 2.2.9 重组表达体系pLVX-SLPI(+)-IRES-ZsGreen1转化 | 第44-45页 |
| 2.2.9.1 质粒转化 | 第44-45页 |
| 2.2.9.2 挑取单菌落培养 | 第45页 |
| 2.2.10 菌落PCR、酶切验证及测序保菌 | 第45-47页 |
| 2.2.10.1 菌落PCR验证 | 第45页 |
| 2.2.10.2 双酶切验证及测序 | 第45-47页 |
| 2.3 SLPI基因沉默体系的构建 | 第47-54页 |
| 2.3.1 RNAi介导的基因沉默机制 | 第47-48页 |
| 2.3.2 SLPIshRNA序列的设计及合成 | 第48-49页 |
| 2.3.3 单链目的基因片段的退火 | 第49-50页 |
| 2.3.4 载体线性化 | 第50-52页 |
| 2.3.4.1 pLVX-shRNA2质粒提取 | 第50-51页 |
| 2.3.4.2 pLVX-shRNA2质粒双酶切 | 第51页 |
| 2.3.4.3 双酶切产物胶回收 | 第51-52页 |
| 2.3.5 线性化载体与shRNA片段的连接 | 第52页 |
| 2.3.6 重组表达体系pLVX-SLPIsiRNA-shRNA2转化 | 第52页 |
| 2.3.7 测序验证 | 第52-54页 |
| 第三章 SLPI基因过表达及SLPI基因沉默稳转细胞系的构建 | 第54-69页 |
| 3.1 pLVX-SLPI-IRES-ZsGreen1慢病毒包装及稳转A375细胞株构建 | 第54-61页 |
| 3.1.1 慢病毒包装 | 第54-57页 |
| 3.1.1.1 293 T细胞的准备 | 第54页 |
| 3.1.1.2 去内毒素提质粒 | 第54-56页 |
| 3.1.1.3 转染 | 第56页 |
| 3.1.1.4 慢病毒收集 | 第56页 |
| 3.1.1.5 慢病毒浓缩 | 第56-57页 |
| 3.1.2 SLPI过表达A375稳转细胞株筛选 | 第57-61页 |
| 3.1.2.1 A375细胞的培养 | 第57-58页 |
| 3.1.2.2 慢病毒感染A375细胞及稳定细胞株筛选 | 第58-61页 |
| 3.2 SLPI基因沉默A375稳转细胞株筛选 | 第61-62页 |
| 3.3 稳转细胞株的鉴定 | 第62-69页 |
| 3.3.1 细胞计数及铺板 | 第62页 |
| 3.3.2 实验组设置 | 第62-63页 |
| 3.3.3 细胞总RNA提取 | 第63-64页 |
| 3.3.4 普通逆转录反应 | 第64-66页 |
| 3.3.5 验证结果 | 第66-69页 |
| 3.3.5.1 设计引物 | 第66页 |
| 3.3.5.2 RT-PCR体系条件及结果 | 第66-69页 |
| 第四章 SLPI促A375细胞迁移的机制研究 | 第69-93页 |
| 4.1 RT-PCR检测SLPI、MMP-2、MMP-9等基因mRNA表达量 | 第69-73页 |
| 4.1.0 U0126的作用及用量 | 第69页 |
| 4.1.1 实验组设置 | 第69-70页 |
| 4.1.2 各实验组细胞总RNA提取 | 第70页 |
| 4.1.3 普通逆转录反应 | 第70页 |
| 4.1.4 RT-PCR检测目的基因的表达量 | 第70-73页 |
| 4.1.4.1 RT-PCR引物设计 | 第70-71页 |
| 4.1.4.2 RT-PCR体系及条件 | 第71-72页 |
| 4.1.4.3 RT-PCR结果 | 第72-73页 |
| 4.2 蛋白免疫印迹实验 | 第73-82页 |
| 4.2.1 实验原理及各组分作用 | 第73-74页 |
| 4.2.2 实验试剂配制 | 第74-76页 |
| 4.2.3 SDS-PAGE的配方 | 第76-77页 |
| 4.2.4 实验方法 | 第77-80页 |
| 4.2.5 结果 | 第80-82页 |
| 4.3 明胶酶谱实验 | 第82-86页 |
| 4.3.1 实验原理 | 第82页 |
| 4.3.2 实验试剂配制 | 第82-84页 |
| 4.3.3 实验方法 | 第84-85页 |
| 4.3.4 实验结果 | 第85-86页 |
| 4.4 Transwell体外迁移及侵袭实验 | 第86-93页 |
| 4.4.1 实验原理及分类 | 第86-88页 |
| 4.4.1.1 共培养体系 | 第86页 |
| 4.4.1.2 趋化性实验 | 第86-87页 |
| 4.4.1.3 肿瘤细胞迁移实验 | 第87页 |
| 4.4.1.4 肿瘤细胞侵袭实验 | 第87-88页 |
| 4.4.2 实验方法 | 第88-89页 |
| 4.4.2.1 Transwell系统预处理 | 第88页 |
| 4.4.2.2 样品准备 | 第88页 |
| 4.4.2.3 细胞铺板 | 第88页 |
| 4.4.2.4 结晶紫染色 | 第88-89页 |
| 4.4.2.5 结果观察 | 第89页 |
| 4.4.3 实验结果 | 第89-93页 |
| 第五章 讨论与展望 | 第93-95页 |
| 致谢 | 第95-97页 |
| 参考文献 | 第97-103页 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表论文目录 | 第103页 |
