| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-21页 |
| 1.1 中度嗜盐菌 | 第10-12页 |
| 1.1.1 中度嗜盐菌的概况 | 第10页 |
| 1.1.2 中度嗜盐菌的应用 | 第10-11页 |
| 1.1.3 嗜盐四联球菌 | 第11-12页 |
| 1.2 中度嗜盐菌的嗜盐机制 | 第12-17页 |
| 1.2.1 相容性溶质 | 第12-15页 |
| 1.2.2 分子伴侣 | 第15页 |
| 1.2.3 嗜盐四联球菌甘氨酸甜菜碱转运机制研究进展 | 第15-17页 |
| 1.3 高效液相色谱法鉴定相容性溶质 | 第17页 |
| 1.4 实时荧光定量PCR | 第17-19页 |
| 1.4.1 实时荧光定量PCR的原理 | 第17页 |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR技术的类型和特点 | 第17-18页 |
| 1.4.3 实时荧光定量的定量方法 | 第18页 |
| 1.4.4 实时荧光定量RT-PCR的应用及优缺点 | 第18-19页 |
| 1.5 多拷贝提高表达量策略 | 第19-20页 |
| 1.5.1 非对称黏性末端互补法 | 第19页 |
| 1.5.2 同尾酶法 | 第19页 |
| 1.5.3 接头连接法 | 第19页 |
| 1.5.4 表达盒串联法 | 第19-20页 |
| 1.5.5 多拷贝表达策略的研究展望 | 第20页 |
| 1.6 本论文的研究意义与主要内容 | 第20-21页 |
| 第二章butA基因转录水平和细胞膜通透性与盐浓度变化的关系 | 第21-35页 |
| 2.1 菌株和试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.1 菌株 | 第21页 |
| 2.1.2 培养基和主要试剂配方 | 第21-22页 |
| 2.2 试剂和仪器 | 第22-24页 |
| 2.2.1 主要试剂盒 | 第22页 |
| 2.2.2 主要试剂及仪器 | 第22-24页 |
| 2.3 荧光定量检测 | 第24-26页 |
| 2.3.1 RT-PCR引物设计 | 第24页 |
| 2.3.2 RNAiso Plus法提取RNA | 第24-25页 |
| 2.3.3 RNA浓度与纯度的检测 | 第25页 |
| 2.3.4 反转录反应 | 第25-26页 |
| 2.3.5 纯化后的RNA和cDNA质量的验证 | 第26页 |
| 2.3.6 RT-PCR | 第26页 |
| 2.4 细胞膜通透性测定方法 | 第26-27页 |
| 2.5 结果 | 第27-33页 |
| 2.5.1 RT-PCR引物的设计与合成 | 第27页 |
| 2.5.2 RNA的提取与检测 | 第27-29页 |
| 2.5.3 RNA的纯化与cDNA的合成 | 第29页 |
| 2.5.4 RT-PCR检测butA基因在不同NaCl浓度下的相对表达量 | 第29-32页 |
| 2.5.5 细胞膜通透性随盐浓度变化 | 第32-33页 |
| 2.6 讨论与分析 | 第33-34页 |
| 2.6.1 嗜盐四联球菌butA的渗透调控 | 第33-34页 |
| 2.6.2 盐激下细胞膜通透性变化 | 第34页 |
| 2.7 本章小结 | 第34-35页 |
| 第三章 单、双拷贝butA基因对大肠杆菌耐盐性的影响 | 第35-60页 |
| 3.1 实验材料 | 第35页 |
| 3.1.1 菌种和质粒 | 第35页 |
| 3.2 试剂和仪器 | 第35-38页 |
| 3.2.1 试剂盒，酶和引物 | 第35页 |
| 3.2.2 培养基 | 第35-36页 |
| 3.2.3 主要试剂配方 | 第36页 |
| 3.2.4 主要试剂 | 第36-37页 |
| 3.2.5 主要仪器设备 | 第37-38页 |
| 3.3 实验方法 | 第38-48页 |
| 3.3.1 菌株的活化与扩大培养 | 第38-39页 |
| 3.3.2 嗜盐四联球菌基因组的提取 | 第39-40页 |
| 3.3.3 大肠杆菌DH 5α 感受态制备 | 第40页 |
| 3.3.4 酶切位点分析与引物设计 | 第40-41页 |
| 3.3.5 单拷贝butA完整表达盒载体的构建 | 第41-45页 |
| 3.3.6 双拷贝butA完整表达盒的构建 | 第45-47页 |
| 3.3.7 重组质粒转化入大肠杆菌MKH13 | 第47页 |
| 3.3.8 重组菌株不同盐浓度下生长曲线的测定 | 第47页 |
| 3.3.9 重组菌株胞内外甘氨酸甜菜碱含量检测 | 第47-48页 |
| 3.4 结果 | 第48-57页 |
| 3.4.1 pButA-S、pButA-D的构建示意图 | 第48-49页 |
| 3.4.2 butA完整表达盒PCR产物凝胶电泳图 | 第49-50页 |
| 3.4.3 butA完整表达盒序列测序及蛋白比对结果 | 第50-51页 |
| 3.4.4 单、双拷贝butA完整表达盒的菌落PCR结果 | 第51页 |
| 3.4.5 pButA-S、pButA-D的酶切鉴定 | 第51-52页 |
| 3.4.6 重组菌在不同盐浓度下生长曲线的测定 | 第52-54页 |
| 3.4.7 重组菌胞内胞外甘氨酸甜菜碱含量的测定 | 第54-57页 |
| 3.5 讨论与分析 | 第57-58页 |
| 3.5.1 甘氨酸甜菜碱提取和检测方法的探索 | 第57-58页 |
| 3.5.2 重组载体拷贝数与作用的关系 | 第58页 |
| 3.5.3 甘氨酸甜菜碱的降解问题 | 第58页 |
| 3.6 本章小结 | 第58-60页 |
| 结论与展望 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-69页 |
| 附录 | 第69-71页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第71-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 附件 | 第73页 |
