| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略语 | 第7-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-20页 |
| 1 CRISPR/Cas9基因编辑技术 | 第12-13页 |
| 2 TBC蛋白质家族 | 第13-14页 |
| 2.1 TBC蛋白质家族简介 | 第13页 |
| 2.2 TBC蛋白质家族功能研究进展 | 第13-14页 |
| 2.3 TBC1D15蛋白质功能研究进展 | 第14页 |
| 3 葡萄糖转运蛋白家族 | 第14-17页 |
| 3.1 葡萄糖转运蛋白家族简介 | 第14-15页 |
| 3.2 葡萄糖转运蛋白的分布 | 第15页 |
| 3.3 GLUT4的转运过程 | 第15-16页 |
| 3.4 Rab蛋白对GLUT4转运的调节 | 第16-17页 |
| 3.5 研究GLUT4在细胞内分布的技术方法 | 第17页 |
| 4 蛋白激酶Akt的研究进展 | 第17-18页 |
| 4.1 蛋白激酶Akt的简介 | 第17-18页 |
| 4.2 蛋白激酶Akt的功能研究 | 第18页 |
| 5 细胞自噬 | 第18-20页 |
| 5.1 细胞自噬的形成 | 第18-19页 |
| 5.2 细胞自噬的研究进展 | 第19-20页 |
| 第二章 实验设计方案 | 第20-23页 |
| 1 实验目的、意义 | 第20-21页 |
| 2 实验内容 | 第21-22页 |
| 3 实验流程图 | 第22-23页 |
| 第三章 CRISPR/Cas9重组载体构建及验证 | 第23-31页 |
| 1 仪器与材料 | 第23-25页 |
| 1.1 仪器 | 第23页 |
| 1.2 材料 | 第23-25页 |
| 2 方法 | 第25-28页 |
| 2.1 sgRNA的设计与构建 | 第25-26页 |
| 2.2 载体酶切 | 第26-27页 |
| 2.3 引物退火产物和pX459载体酶切产物连接反应 | 第27页 |
| 2.4 Inoue法制备E.coli DH5α超级感受态细胞 | 第27页 |
| 2.5 连接产物的转化 | 第27-28页 |
| 2.6 pX459重组质粒的提取与鉴定 | 第28页 |
| 3 实验结果 | 第28-29页 |
| 3.1 pX459重组质粒测序结果 | 第28-29页 |
| 4 讨论 | 第29-31页 |
| 第四章 TBC1D15~(-/-)L02和L6细胞株的构建 | 第31-45页 |
| 1 仪器与材料 | 第31-33页 |
| 1.1 仪器 | 第31页 |
| 1.2 材料 | 第31-33页 |
| 2 方法 | 第33-38页 |
| 2.1 pX459及pX462重组质粒的提取 | 第33页 |
| 2.2 L02及L6细胞复苏、传代培养和冻存 | 第33-34页 |
| 2.3 MTT实验确定L02及L6细胞的最佳嘌呤霉素筛选浓度 | 第34页 |
| 2.4 TBC1D15~(-/-)L02及L6细胞株的构建 | 第34-38页 |
| 3 实验结果 | 第38-44页 |
| 3.1 L02及L6细胞的最适嘌呤霉素浓度的筛选 | 第38-39页 |
| 3.2 敲除效率检测结果 | 第39-41页 |
| 3.3 蛋白表达水平上检测TBC1D15的表达 | 第41页 |
| 3.4 基因组PCR检测结果 | 第41-43页 |
| 3.5 TBC1D15~(-/-)单克隆细胞株与正常细胞的形态学对比 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-45页 |
| 第五章 TBC1D15~(-/-)细胞株的糖摄取功能及分子机制的研究 | 第45-58页 |
| 1 仪器与材料 | 第45-46页 |
| 1.1 仪器 | 第45页 |
| 1.2 材料 | 第45-46页 |
| 2 方法 | 第46-49页 |
| 2.1 流式细胞术检测细胞水平上糖吸收变化 | 第46页 |
| 2.2 蛋白水平上检测GLUT4、Rab7和LC3B的表达 | 第46-47页 |
| 2.3 免疫荧光技术检测GLUT4、Rab7和Lamp1蛋白在细胞中的分布情况 | 第47-49页 |
| 3 实验结果 | 第49-55页 |
| 3.1 细胞水平上检测糖吸收的变化 | 第49-50页 |
| 3.2 GLUT4蛋白、Rab7蛋白和LC3B蛋白的检测结果 | 第50-51页 |
| 3.3 pEGFP-HA-GLUT4重组载体双酶切鉴定 | 第51-52页 |
| 3.4 L02及L6细胞最适G-418浓度的筛选 | 第52页 |
| 3.5 L02细胞内EGFP和HA的共定位 | 第52-53页 |
| 3.6 L02细胞内Rab7的分布情况 | 第53-54页 |
| 3.7 L02细胞内Rab7分别与GLUT4和Lamp1的共定位情况 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-58页 |
| 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
