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开菲尔乳杆菌醇脱氢酶的分子改造提高不对称合成(S)-CHOH的催化活性

致谢第5-6页
摘要第6-7页
Abstract第7-8页
第一章 文献综述第12-22页
    1.1 他汀类药物简介第12页
    1.2 生物催化制备(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯第12-14页
        1.2.1 (S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的重要用途第12页
        1.2.2 (S)-CHOH的合成路径第12-13页
        1.2.3 以CDOH为底物合成(S)-CHOH的研究进展第13-14页
    1.3 醇脱氢酶概述第14-16页
        1.3.1 醇脱氢酶简介第14页
        1.3.2 醇脱氢酶的分类第14页
        1.3.3 SDR的结构第14-15页
        1.3.4 醇脱氢酶催化羰基不对称还原的机理第15-16页
    1.4 醇脱氢酶的分子改造第16-21页
        1.4.1 酶的定向进化第17-18页
        1.4.2 酶的理性设计第18页
        1.4.3 酶的半理性设计第18-19页
        1.4.4 LkADH和LbADH的分子改造研究第19-20页
        1.4.5 酶的高通量筛选模型的建立第20-21页
    1.5 本课题的研究思路和研究内容第21-22页
第二章 醇脱氢酶M_(F147L-A202L)的半理性设计第22-50页
    2.1 引言第22页
    2.2 实验材料第22-26页
        2.2.1 菌种与质粒第22页
        2.2.2 主要实验仪器及设备第22-23页
        2.2.3 实验试剂与药品第23-25页
        2.2.4 溶液及培养基的配制第25-26页
    2.3 实验方法第26-34页
        2.3.1 菌种的保藏和活化第26-27页
        2.3.2 质粒的提取第27页
        2.3.3 DNA切胶回收第27页
        2.3.4 核酸琼脂糖凝胶电泳第27页
        2.3.5 定点突变引物设计第27-29页
        2.3.6 感受态细胞的制备第29页
        2.3.7 突变子的构建第29-30页
        2.3.8 突变酶的表达与纯化第30-31页
        2.3.9 不对称合成(S)-CHOH过程的酶活测定方法第31页
        2.3.10 不对称合成(S)-CHOH过程的液相分析方法第31-32页
        2.3.11 分子对接第32-33页
        2.3.12 虚拟丙氨酸扫描第33页
        2.3.13 蛋白质浓度的测定第33页
        2.3.14 动力学参数测定第33-34页
    2.4 结果与讨论第34-48页
        2.4.1 关键位点147、202的饱和突变第34-36页
        2.4.2 醇脱氢酶M_(F147I-A202L)的同源建模第36-38页
        2.4.3 醇脱氢酶M_(F147I-A202L)与底物CDOH的分子对接第38-39页
        2.4.4 基于催化活性口袋的半理性设计第39-41页
        2.4.5 虚拟突变第41-42页
        2.4.6 突变点的组合第42-45页
        2.4.7 突变体的动力学分析第45-47页
        2.4.8 突变位点的作用机理解析第47-48页
    2.5 本章小结第48-50页
第三章 醇脱氢酶M_(F147I-A202L)的定向进化第50-68页
    3.1 引言第50页
    3.2 实验材料第50页
        3.2.1 菌种与质粒第50页
        3.2.2 主要实验仪器及设备第50页
        3.2.3 实验试剂与药品第50页
        3.2.4 溶液及培养基的配制第50页
    3.3 实验方法第50-56页
        3.3.1 高通量筛选方法的建立第51-52页
        3.3.2 易错PCR条件的确定第52-53页
        3.3.3 双酶切、酶连及PCR产物回收第53页
        3.3.4 高通量筛选过程第53-55页
        3.3.5 文库突变率的测定第55页
        3.3.6 突变子的复筛第55-56页
    3.4 结果与讨论第56-67页
        3.4.1 高通量筛选方法的建立第56-63页
        3.4.2 突变文库的建立第63-65页
        3.4.3 定向进化的结果第65-67页
    3.5 本章小结第67-68页
第四章 M_(F147I-A202L-Y190F-S96A)酶学性质研究及产酶条件优化第68-82页
    4.1 引言第68页
    4.2 实验材料与设备第68-69页
        4.2.1 菌种与质粒第68页
        4.2.2 主要实验仪器与设备第68页
        4.2.3 实验试剂与药品第68-69页
        4.2.4 溶液及培养基的配制第69页
    4.3 实验方法第69-70页
        4.3.1 醇脱氢酶M_(F147I-A202L-Y190F-S96A)酶学性质研究第69页
        4.3.2 醇脱氢酶M_(F147I-A202LY190F-S96A)产酶条件的优化第69-70页
    4.4 结果与讨论第70-79页
        4.4.1 酶学性质第70-74页
        4.4.2 产酶条件优化第74-79页
    4.5 本章小结第79-82页
第五章 结论与展望第82-84页
    5.1 结论第82-83页
    5.2 展望第83-84页
参考文献第84-90页
附录A 本研究涉及的基因序列第90-91页
附录B 定点饱和突变酶活数据第91-92页
作者简介第92页

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