致谢 | 第5-6页 |
摘要 | 第6-7页 |
Abstract | 第7-8页 |
第一章 文献综述 | 第12-22页 |
1.1 他汀类药物简介 | 第12页 |
1.2 生物催化制备(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯 | 第12-14页 |
1.2.1 (S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的重要用途 | 第12页 |
1.2.2 (S)-CHOH的合成路径 | 第12-13页 |
1.2.3 以CDOH为底物合成(S)-CHOH的研究进展 | 第13-14页 |
1.3 醇脱氢酶概述 | 第14-16页 |
1.3.1 醇脱氢酶简介 | 第14页 |
1.3.2 醇脱氢酶的分类 | 第14页 |
1.3.3 SDR的结构 | 第14-15页 |
1.3.4 醇脱氢酶催化羰基不对称还原的机理 | 第15-16页 |
1.4 醇脱氢酶的分子改造 | 第16-21页 |
1.4.1 酶的定向进化 | 第17-18页 |
1.4.2 酶的理性设计 | 第18页 |
1.4.3 酶的半理性设计 | 第18-19页 |
1.4.4 LkADH和LbADH的分子改造研究 | 第19-20页 |
1.4.5 酶的高通量筛选模型的建立 | 第20-21页 |
1.5 本课题的研究思路和研究内容 | 第21-22页 |
第二章 醇脱氢酶M_(F147L-A202L)的半理性设计 | 第22-50页 |
2.1 引言 | 第22页 |
2.2 实验材料 | 第22-26页 |
2.2.1 菌种与质粒 | 第22页 |
2.2.2 主要实验仪器及设备 | 第22-23页 |
2.2.3 实验试剂与药品 | 第23-25页 |
2.2.4 溶液及培养基的配制 | 第25-26页 |
2.3 实验方法 | 第26-34页 |
2.3.1 菌种的保藏和活化 | 第26-27页 |
2.3.2 质粒的提取 | 第27页 |
2.3.3 DNA切胶回收 | 第27页 |
2.3.4 核酸琼脂糖凝胶电泳 | 第27页 |
2.3.5 定点突变引物设计 | 第27-29页 |
2.3.6 感受态细胞的制备 | 第29页 |
2.3.7 突变子的构建 | 第29-30页 |
2.3.8 突变酶的表达与纯化 | 第30-31页 |
2.3.9 不对称合成(S)-CHOH过程的酶活测定方法 | 第31页 |
2.3.10 不对称合成(S)-CHOH过程的液相分析方法 | 第31-32页 |
2.3.11 分子对接 | 第32-33页 |
2.3.12 虚拟丙氨酸扫描 | 第33页 |
2.3.13 蛋白质浓度的测定 | 第33页 |
2.3.14 动力学参数测定 | 第33-34页 |
2.4 结果与讨论 | 第34-48页 |
2.4.1 关键位点147、202的饱和突变 | 第34-36页 |
2.4.2 醇脱氢酶M_(F147I-A202L)的同源建模 | 第36-38页 |
2.4.3 醇脱氢酶M_(F147I-A202L)与底物CDOH的分子对接 | 第38-39页 |
2.4.4 基于催化活性口袋的半理性设计 | 第39-41页 |
2.4.5 虚拟突变 | 第41-42页 |
2.4.6 突变点的组合 | 第42-45页 |
2.4.7 突变体的动力学分析 | 第45-47页 |
2.4.8 突变位点的作用机理解析 | 第47-48页 |
2.5 本章小结 | 第48-50页 |
第三章 醇脱氢酶M_(F147I-A202L)的定向进化 | 第50-68页 |
3.1 引言 | 第50页 |
3.2 实验材料 | 第50页 |
3.2.1 菌种与质粒 | 第50页 |
3.2.2 主要实验仪器及设备 | 第50页 |
3.2.3 实验试剂与药品 | 第50页 |
3.2.4 溶液及培养基的配制 | 第50页 |
3.3 实验方法 | 第50-56页 |
3.3.1 高通量筛选方法的建立 | 第51-52页 |
3.3.2 易错PCR条件的确定 | 第52-53页 |
3.3.3 双酶切、酶连及PCR产物回收 | 第53页 |
3.3.4 高通量筛选过程 | 第53-55页 |
3.3.5 文库突变率的测定 | 第55页 |
3.3.6 突变子的复筛 | 第55-56页 |
3.4 结果与讨论 | 第56-67页 |
3.4.1 高通量筛选方法的建立 | 第56-63页 |
3.4.2 突变文库的建立 | 第63-65页 |
3.4.3 定向进化的结果 | 第65-67页 |
3.5 本章小结 | 第67-68页 |
第四章 M_(F147I-A202L-Y190F-S96A)酶学性质研究及产酶条件优化 | 第68-82页 |
4.1 引言 | 第68页 |
4.2 实验材料与设备 | 第68-69页 |
4.2.1 菌种与质粒 | 第68页 |
4.2.2 主要实验仪器与设备 | 第68页 |
4.2.3 实验试剂与药品 | 第68-69页 |
4.2.4 溶液及培养基的配制 | 第69页 |
4.3 实验方法 | 第69-70页 |
4.3.1 醇脱氢酶M_(F147I-A202L-Y190F-S96A)酶学性质研究 | 第69页 |
4.3.2 醇脱氢酶M_(F147I-A202LY190F-S96A)产酶条件的优化 | 第69-70页 |
4.4 结果与讨论 | 第70-79页 |
4.4.1 酶学性质 | 第70-74页 |
4.4.2 产酶条件优化 | 第74-79页 |
4.5 本章小结 | 第79-82页 |
第五章 结论与展望 | 第82-84页 |
5.1 结论 | 第82-83页 |
5.2 展望 | 第83-84页 |
参考文献 | 第84-90页 |
附录A 本研究涉及的基因序列 | 第90-91页 |
附录B 定点饱和突变酶活数据 | 第91-92页 |
作者简介 | 第92页 |