| 致谢 | 第6-10页 |
| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 1 苏云金芽孢杆菌及Cry蛋白概述 | 第15-45页 |
| 1.1 Cry蛋白的类型 | 第16-18页 |
| 1.2 Cry蛋白的结构及作用机理 | 第18-26页 |
| 1.2.1 Cry蛋白的结构 | 第18-19页 |
| 1.2.2 Bt蛋白的杀虫机理 | 第19-26页 |
| 1.3 昆虫对Cry蛋白的抗性及其机理 | 第26-29页 |
| 1.4 昆虫抗性治理策略 | 第29-34页 |
| 1.5 植物多基因转化 | 第34-37页 |
| 1.6 2A肽段简介、作用机理及其在多基因转化中的应用 | 第37-44页 |
| 1.6.1 2A肽段的发现及简介 | 第37-39页 |
| 1.6.2 2A肽段的作用机理 | 第39-42页 |
| 1.6.3 2A策略在多基因转化中的应用 | 第42-44页 |
| 1.7 研究的目的与意义 | 第44-45页 |
| 2 材料与方法 | 第45-58页 |
| 2.1 材料 | 第45-46页 |
| 2.1.1 菌株 | 第45页 |
| 2.1.2 受体植物 | 第45页 |
| 2.1.3 质粒载体 | 第45页 |
| 2.1.4 实验用酶 | 第45页 |
| 2.1.5 其他常用物品 | 第45-46页 |
| 2.1.6 常用试剂 | 第46页 |
| 2.2 研究中使用的实验方法 | 第46-58页 |
| 2.2.1 PCR | 第46页 |
| 2.2.2 质粒小量制备 | 第46页 |
| 2.2.3 酶切 | 第46-47页 |
| 2.2.4 凝胶回收 | 第47页 |
| 2.2.5 DNA片段连接 | 第47页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态的制备及转化 | 第47-48页 |
| 2.2.7 根癌农杆菌感受态的制备及转化 | 第48-49页 |
| 2.2.8 CTAB法提取植物基因组 | 第49-50页 |
| 2.2.9 Trizol法提取植物RNA | 第50页 |
| 2.2.10 cDNA第一链的合成 | 第50页 |
| 2.2.11 Southern Blot印迹 | 第50-53页 |
| 2.2.12 Western Blot印迹检测 | 第53-54页 |
| 2.2.13 CrylAb和Cry2Ab ELISA定量 | 第54-55页 |
| 2.2.14 农杆菌介导水稻转基因 | 第55-57页 |
| 2.2.15 昆虫生测 | 第57-58页 |
| 3 1Ac-223(1/2Ac)载体构建及转基因水稻分析 | 第58-80页 |
| 3.1 载体构建 | 第58-61页 |
| 3.1.1 构建草甘膦抗性表达框 | 第58页 |
| 3.1.2 构建223表达框 | 第58-59页 |
| 3.1.3 构建CrylAc表达框 | 第59-61页 |
| 3.2 农杆菌介导水稻转化 | 第61页 |
| 3.3 转基因水稻鉴定及分析 | 第61-66页 |
| 3.3.1 Western blot鉴定转基因水稻基因表达水平 | 第61-62页 |
| 3.3.2 Southern blot鉴定基因插入拷贝数 | 第62页 |
| 3.3.3 Tail-PCR检测水稻转基因插入位点 | 第62-64页 |
| 3.3.4 水稻纯合子筛选及分析 | 第64-66页 |
| 3.4 实验结果 | 第66-80页 |
| 3.4.1 转基因载体的鉴定 | 第66-67页 |
| 3.4.2 1/2Ac转基因苗的获得 | 第67-68页 |
| 3.4.3 1Ac和223表达水平高的转化株筛选 | 第68-69页 |
| 3.4.4 单拷贝插入转化株筛选 | 第69-70页 |
| 3.4.5 检测1/2Ac-A和1/2Ac-B基因组插入位点 | 第70-74页 |
| 3.4.6 筛选T1代1/2Ac-A纯合子植株 | 第74-75页 |
| 3.4.7 1/2Ac-AH转基因纯合子植株分析 | 第75-80页 |
| 4 2A策略表达Cry1Ab和Cry2Ab载体构建及转基因水稻分析 | 第80-93页 |
| 4.1 载体构建 | 第80-83页 |
| 4.1.1 草甘膦抗性表达框 | 第80页 |
| 4.1.2 2A融合基因表达框 | 第80-83页 |
| 4.2 农杆菌介导水稻转化 | 第83页 |
| 4.3 转基因水稻鉴定及分析 | 第83-85页 |
| 4.3.1 Western Blot筛选各基因转基因植株 | 第83页 |
| 4.3.2 PCR检测水稻基因组中Cry1Ab和Cry2A基因 | 第83-84页 |
| 4.3.3 RT-PCR检测转基因水稻融合基因转录 | 第84页 |
| 4.3.4 Western Blot检测转基因水稻蛋白表达情况 | 第84页 |
| 4.3.5 ELISA测定转基因植株Cry1Ab及Cry2Ab含量 | 第84-85页 |
| 4.4 2A多基因表达实验结果 | 第85-93页 |
| 4.4.1 2A多基因表达载体的鉴定 | 第85页 |
| 4.4.2 转基因植株Western Blot筛选 | 第85-86页 |
| 4.4.3 转基因植株中基因的插入 | 第86-87页 |
| 4.4.4 转基因植株中融合基因的转录 | 第87-88页 |
| 4.4.5 转基因植株Cry1Ab和Cry2Ab的表达 | 第88-89页 |
| 4.4.6 2A转基因植株抗虫活性测定 | 第89-91页 |
| 4.4.7 Cry1Ab与Cry2Ab定量及2A效率比较 | 第91-93页 |
| 5 讨论 | 第93-99页 |
| 参考文献 | 第99-109页 |
| 附录 实验常用溶液配方 | 第109-120页 |
