| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 縮略语表 | 第12-13页 |
| 1 引言 | 第13-24页 |
| 1.1 志贺氏菌概述 | 第13页 |
| 1.2 志贺氏菌感染途径 | 第13-14页 |
| 1.3 志贺氏菌致病机制模型 | 第14页 |
| 1.4 志贺氏菌侵入肠上皮细胞 | 第14-15页 |
| 1.5 志贺氏菌编码的关键蛋白 | 第15-19页 |
| 1.5.1 Ⅲ型分泌系统分泌的蛋白 | 第15-18页 |
| 1.5.2 外膜蛋白VirG(IcsA) | 第18-19页 |
| 1.6 志贺氏菌的进化 | 第19-21页 |
| 1.7 膜蛋白复合物 | 第21页 |
| 1.8 蛋白质组研究技术(与电泳相关) | 第21-22页 |
| 1.8.1 双向凝胶电泳技术 | 第21页 |
| 1.8.2 蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Blue Native PAGE,BN-PAGE) | 第21-22页 |
| 1.9 前期工作基础 | 第22-23页 |
| 1.10 本课题研究的科学问题 | 第23-24页 |
| 第一部分 M90T-290组成成分的研究 | 第24-52页 |
| 2 实验一 利用BN-PAGE分离志贺氏菌5a M90T缺失突变株膜蛋白复合物 | 第24-30页 |
| 2.1 材料与方法 | 第24-26页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 实验主要仪器 | 第24-25页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第25-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-27页 |
| 2.2.1 实验方案 | 第26页 |
| 2.2.2 M90T膜蛋白复合物的制备 | 第26-27页 |
| 2.2.3 BN-PAGE分离膜蛋白复合物 | 第27页 |
| 2.3 实验结果 | 第27-28页 |
| 2.4 讨论 | 第28-30页 |
| 3 实验二 M90T-290各亚基相互作用分析 | 第30-52页 |
| 3.1 实验材料 | 第30-32页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第30页 |
| 3.1.2 主要仪器 | 第30-31页 |
| 3.1.3 主要试剂和抗体 | 第31-32页 |
| 3.2 实验方法 | 第32-38页 |
| 3.2.1 质粒pET-32a(+)S的构建 | 第32-34页 |
| 3.2.2 常规的方法构建重组质粒(phoN2-HIS、phoN2-S、dnaK-HIS、ydgA-GFP、gapA-GFP、ef-tu-HIS) | 第34-36页 |
| 3.2.3 LIC进行克隆重组质粒(clpB-T7、vriG-S、gapA-T7、ef-tu-S) | 第36-37页 |
| 3.2.4 标签蛋白的融合表达 | 第37-38页 |
| 3.2.5 融合蛋白的纯化 | 第38页 |
| 3.2.6 体外结合实验 | 第38页 |
| 3.3 实验结果 | 第38-51页 |
| 3.3.1 成功构建仅表达pET32a(+)S的载体 | 第39-40页 |
| 3.3.2 phoN2-HIS、phoN2-S、dnaK-HIS、ydgA-GFP、gapA-GFP、ef-tu-HIS重组质粒构建成功 | 第40-43页 |
| 3.3.3 LIC成功克隆clpB-T7、vriG-S、gapA-T7、ef-tu-S重组质粒 | 第43-45页 |
| 3.3.4 融合蛋白均为可溶性蛋白 | 第45-49页 |
| 3.3.5 融合蛋白的纯化 | 第49页 |
| 3.3.6 Pull-down实验表明M90T-290各亚基之间存在广泛的两两相互作用 | 第49-51页 |
| 3.4 讨论 | 第51-52页 |
| 第二部分 M90T-290与志贺氏菌M90T株毒力相关研究 | 第52-62页 |
| 4 实验三 志贺氏菌M90T感染HeLa细胞体外模型的建立 | 第52-55页 |
| 4.1 实验材料 | 第52页 |
| 4.2 实验方法 | 第52-53页 |
| 4.2.1 M90T感染HeLa细胞 | 第52页 |
| 4.2.2 姬姆萨染色 | 第52-53页 |
| 4.3 实验结果 | 第53-54页 |
| 4.3.1 细菌与HeLa细胞比例的确定 | 第53页 |
| 4.3.2 志贺氏菌M90T感染HeLa细胞换液时间的优化结果 | 第53-54页 |
| 4.4 讨论 | 第54-55页 |
| 5 实验四 M90T-290功能验证 | 第55-62页 |
| 5.1 实验材料 | 第55页 |
| 5.2 主要试剂和实验仪器 | 第55页 |
| 5.3 实验方法 | 第55-57页 |
| 5.3.1 回复株的构建 | 第55-56页 |
| 5.3.2 M90T-290各亚基缺失株基因水平上验证 | 第56页 |
| 5.3.3 HeLa细胞侵袭实验 | 第56页 |
| 5.3.4 豚鼠角膜实验 | 第56-57页 |
| 5.4 结果 | 第57-61页 |
| 5.4.1 PCR鉴定M90T各亚基缺失株及相应回复株存在关键毒力基因 | 第57-58页 |
| 5.4.2 M90T-290各亚基缺失株感染HeLa细胞的能力减弱 | 第58-60页 |
| 5.4.3 M90T-290各亚基缺失株感染豚鼠角膜引起的炎症减弱 | 第60-61页 |
| 5.5 讨论 | 第61-62页 |
| 第三部分 M90T-290毒力机制的初步探索 | 第62-75页 |
| 6 实验五 M90T-290中各亚基对VirG极性分布及细胞骨架蛋白的影响 | 第62-67页 |
| 6.1 实验材料 | 第62页 |
| 6.2 实验方法 | 第62-63页 |
| 6.2.1 M90T感染HeLa细胞 | 第62页 |
| 6.2.2 VirG荧光染色 | 第62-63页 |
| 6.2.3 细胞骨架蛋白荧光染色 | 第63页 |
| 6.3 实验结果 | 第63-66页 |
| 6.4 讨论 | 第66-67页 |
| 7 实验六 鼠抗Apyrase-HIS、DnaK-HIS和GapA-HIS多克隆抗体制备及检测 | 第67-73页 |
| 7.1 实验材料 | 第67页 |
| 7.2 实验方法 | 第67-68页 |
| 7.2.1 融合蛋白的纯度和浓度的测定 | 第67-68页 |
| 7.2.2 融合蛋白免疫制备多克隆抗体实验 | 第68页 |
| 7.2.3 多克隆抗体效价检测 | 第68页 |
| 7.3 实验结果 | 第68-72页 |
| 7.3.1 获得高纯度融合蛋白 | 第68-69页 |
| 7.3.2 多克隆抗体的效价及特异性检测 | 第69-72页 |
| 7.4 讨论 | 第72-73页 |
| 8 实验七 免疫印迹检测Apyrase、DnaK及YdgA间的调控关系 | 第73-75页 |
| 8.1 实验材料 | 第73页 |
| 8.2 实验方法 | 第73页 |
| 8.3 实验结果与讨论 | 第73-75页 |
| 第四部分 M90T-290具体来源的研究 | 第75-83页 |
| 9 实验八 BN/SDS-PAGE分离膜蛋白复合物M90T-290和M90T-260 | 第75-81页 |
| 9.1 实验材料 | 第75页 |
| 9.1.1 菌株 | 第75页 |
| 9.1.2 实验主要仪器与试剂 | 第75页 |
| 9.2 实验方法 | 第75-76页 |
| 9.2.1 BN-PAGE分离M90T野生株与M90T △ pWR100膜蛋白复合物 | 第75页 |
| 9.2.2 膜蛋白复合物M90T-290、M90T-260二向SDS-PAGE | 第75页 |
| 9.2.3 胶内酶切及质谱鉴定 | 第75页 |
| 9.2.4 BN-PAGE分离M90T野生株、M90T △phoN2和M90T △phoN2/pET24a(Phi sApyrase)膜蛋白复合物 | 第75页 |
| 9.2.5 体外鉴定重组表达Apyrase与△phoN2膜蛋白复合物的结合 | 第75-76页 |
| 9.3 实验结果 | 第76-81页 |
| 9.3.1 DnaK、YdgA、EF-TU和GapA形成M90T-260,即M90T-290=Apyrase+M90T-260 | 第76-80页 |
| 9.3.2 重组表达的Apyrase可以在体内、体外结合染色体编码的预先形成的亚复合物形成M90T-290 | 第80-81页 |
| 9.4 讨论 | 第81页 |
| 10 结论 | 第81-82页 |
| 11 本课题创新之处 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-93页 |
| 作者简介 | 第93页 |
