| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第14-30页 |
| 1.1 弓形虫及弓形虫病 | 第14-18页 |
| 1.2 弓形虫Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型对宿主的毒力差异 | 第18-19页 |
| 1.3 弓形虫毒力相关因子的研究 | 第19-21页 |
| 1.4 多态性GRA15蛋白的研究进展 | 第21-23页 |
| 1.5 酵母双杂交技术及其在弓形虫与宿主互作研究方面的应用 | 第23-25页 |
| 1.6 转录组技术及质粒转染细胞后测转录组的可行性 | 第25-27页 |
| 1.7 生物信息学 | 第27-29页 |
| 1.8 研究的目的及意义 | 第29-30页 |
| 第二章 弓形虫MIC6/7/8与宿主Spata3和Dkk2蛋白的互作分析 | 第30-48页 |
| 2.1 材料 | 第30-31页 |
| 2.1.1 虫种和试验动物 | 第30页 |
| 2.1.2 质粒及受体菌 | 第30页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第30-31页 |
| 2.1.4 主要设备及仪器 | 第31页 |
| 2.2 方法 | 第31-42页 |
| 2.2.1 主要试剂配制 | 第31-33页 |
| 2.2.1.1 大肠杆菌培养基及配制 | 第31-32页 |
| 2.2.1.2 酵母培养基及配制 | 第32-33页 |
| 2.2.1.3 核酸电泳有关试剂配制 | 第33页 |
| 2.2.2 RH虫株MIC6/7/8和鼠Spata3和Dkk2基因的扩增及鉴定 | 第33-39页 |
| 2.2.2.1 弓形虫RH虫株的传代 | 第33页 |
| 2.2.2.2 弓形虫RH虫株的速殖子和小鼠肾总RNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.2.3 弓形虫RH虫株和小鼠cDNA的合成 | 第34-35页 |
| 2.2.2.4 弓形虫MIC6/7/8和小鼠Spata3及Dkk2基因的扩增 | 第35-37页 |
| 2.2.2.5 目的基因克隆至pMD19T(simple)载体 | 第37-39页 |
| 2.2.3 诱饵载体和捕获载体的构建及鉴定 | 第39-40页 |
| 2.2.4 诱饵载体和捕获载体的毒性和自激活性的检测 | 第40-42页 |
| 2.2.4.1 复苏酵母菌种 | 第40页 |
| 2.2.4.2 酵母菌种的保存 | 第40页 |
| 2.2.4.3 酵母感受态细胞的制备 | 第40-41页 |
| 2.2.4.4 酵母转化 | 第41-42页 |
| 2.2.5 酵母点对点验证 | 第42页 |
| 2.2.5.1 DDO培养基上验证蛋白相互作用 | 第42页 |
| 2.2.5.2 QDO培养基上验证蛋白相互作用 | 第42页 |
| 2.3 结果 | 第42-46页 |
| 2.3.1 MIC6/7/8及Spata3/Dkk2的PCR扩增 | 第42-43页 |
| 2.3.2 诱饵载体及捕获载体的酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 2.3.3 诱饵载体、捕获载体毒性、自激活性的检测 | 第44页 |
| 2.3.4 在DDO培养基上的蛋白互作验证 | 第44-45页 |
| 2.3.5 在QDO培养基上的蛋白互作验证 | 第45-46页 |
| 2.4 讨论 | 第46-48页 |
| 第三章 与弓形虫PRU虫株GRA15蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定 | 第48-73页 |
| 3.1 材料 | 第48-50页 |
| 3.1.1 虫种和试验动物 | 第48页 |
| 3.1.2 质粒及受体菌 | 第48页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第48-49页 |
| 3.1.4 主要仪器及设备 | 第49-50页 |
| 3.2 方法 | 第50-64页 |
| 3.2.1 主要试剂配制 | 第50-53页 |
| 3.2.1.1 大肠杆菌培养基及其配制 | 第50页 |
| 3.2.1.2 酵母培养基及其配制 | 第50-51页 |
| 3.2.1.3 核酸电泳有关试剂配制 | 第51页 |
| 3.2.1.4 SDS-PAGE有关试剂配制 | 第51-52页 |
| 3.2.1.5 TCA法提取酵母蛋白相关试剂的配制 | 第52-53页 |
| 3.2.2 弓形虫PRU虫株的GRA15基因的扩增和鉴定 | 第53-56页 |
| 3.2.2.1 弓形虫PRU虫株的传代 | 第53页 |
| 3.2.2.2 弓形虫PRU虫株的包囊的收集及总RNA的提取 | 第53-54页 |
| 3.2.2.3 弓形虫PRU虫株的包囊cDNA的合成 | 第54页 |
| 3.2.2.4 弓形虫PRU虫株的包囊GRA15基因的扩增 | 第54-55页 |
| 3.2.2.5 构建pMD19T-GRA15载体 | 第55-56页 |
| 3.2.3 构建pGBKT7-GRA15载体 | 第56-57页 |
| 3.2.3.1 pGBKT7和重组pMD19T-GRA15载体的双酶切 | 第56-57页 |
| 3.2.3.2 目的基因酶切产物与pGBKT7载体的连接 | 第57页 |
| 3.2.3.3 阳性重组质粒的获得 | 第57页 |
| 3.2.4 GRA15诱饵蛋白在酵母内的表达验证 | 第57-59页 |
| 3.2.4.1 pGBKT7-GRA15转化Y2HGold酵母菌 | 第57页 |
| 3.2.4.2 诱饵蛋白的表达 | 第57-58页 |
| 3.2.4.3 SDS-PAGE蛋白电泳及转膜 | 第58-59页 |
| 3.2.4.4 免疫反应 | 第59页 |
| 3.2.5 诱饵蛋白的自激活及毒性检测 | 第59-60页 |
| 3.2.5.1 诱饵蛋白的自激活检测 | 第59-60页 |
| 3.2.5.2 诱饵质粒毒性的检测 | 第60页 |
| 3.2.6 酵母接合以及文库的筛选 | 第60-63页 |
| 3.2.6.1 酵母接合及DDO/X/A培养基上筛选 | 第60-61页 |
| 3.2.6.2 QDO/X/A对潜在的阳性克隆再筛选 | 第61页 |
| 3.2.6.3 文库质粒的拯救与纯化 | 第61-63页 |
| 3.2.6.4 文库质粒的纯化 | 第63页 |
| 3.2.6.5 文库质粒的测序及分析 | 第63页 |
| 3.2.7 阳性互作的回返验证 | 第63-64页 |
| 3.2.8 生物信息学分析 | 第64页 |
| 3.3 结果 | 第64-70页 |
| 3.3.1 PCR扩增PRU虫株的包囊cDNA中GRA15基因 | 第64页 |
| 3.3.2 pGBKT7-GRA15载体转化DH5α感受态后菌落PCR验证 | 第64-65页 |
| 3.3.3 重组质粒酶切鉴定结果 | 第65-66页 |
| 3.3.4 GRA15诱饵蛋白的表达检测 | 第66页 |
| 3.3.5 重组质粒转化Y2HGold酵母菌后的自激活及毒性检测 | 第66-67页 |
| 3.3.6 PCR分析潜在的阳性克隆 | 第67-68页 |
| 3.3.7 GRA15与筛选宿主蛋白的酵母点对点验证 | 第68-69页 |
| 3.3.8 阳性互作中文库插入片段的测序鉴定和生物信息学分析 | 第69-70页 |
| 3.4 讨论 | 第70-73页 |
| 第四章 GT1和PRU虫株GRA15蛋白对宿主细胞信号通路的影响 | 第73-104页 |
| 4.1 材料 | 第73-74页 |
| 4.1.1 虫株的和细胞 | 第73页 |
| 4.1.2 质粒和受体菌 | 第73页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第73-74页 |
| 4.1.4 主要设备及仪器 | 第74页 |
| 4.2 方法 | 第74-89页 |
| 4.2.1 主要试剂的配制 | 第74-75页 |
| 4.2.1.1 大肠杆菌培养基及其配制 | 第74页 |
| 4.2.1.2 细胞培养试剂 | 第74-75页 |
| 4.2.1.3 SDS-PAGE有关试剂配制 | 第75页 |
| 4.2.1.4 核酸电泳有关试剂配制 | 第75页 |
| 4.2.2 弓形虫GT1和PRU虫株的GRA15基因的扩增和鉴定 | 第75-79页 |
| 4.2.2.1 弓形虫GT1虫株的速殖子的培养和收集 | 第75页 |
| 4.2.2.2 弓形虫GT1及PRU虫株总RNA的提取 | 第75-76页 |
| 4.2.2.3 逆转录合成cDNA | 第76页 |
| 4.2.2.4 GRA15基因的扩增 | 第76-78页 |
| 4.2.2.5 克隆GT1和PRU虫株的GRA15基因至T载体 | 第78-79页 |
| 4.2.3 克隆GT1和PRU虫株GRA15基因至pCMV-N-mCherry载体 | 第79-80页 |
| 4.2.3.1 载体的双酶切 | 第79页 |
| 4.2.3.2 酶切产物的胶回收纯化 | 第79页 |
| 4.2.3.3 目的基因与pCMV-N-mCherry载体的连接及转化 | 第79-80页 |
| 4.2.4 重组质粒的大量提取 | 第80-81页 |
| 4.2.5 重组载体的细胞转染 | 第81-82页 |
| 4.2.5.1 鼠BHK-21细胞的复苏 | 第81页 |
| 4.2.5.2 鼠BHK-21细胞的传代培养 | 第81-82页 |
| 4.2.5.3 细胞的冻存 | 第82页 |
| 4.2.6 IFA检测GRA15蛋白在细胞内的表达 | 第82-83页 |
| 4.2.7 转录组样品制备及GRA15蛋白表达的Westernblotting检测 | 第83-85页 |
| 4.2.8 用于转录组测序的样品RNA的提取 | 第85-86页 |
| 4.2.9 RNA样品检测 | 第86页 |
| 4.2.10 cDNA文库的构建 | 第86-87页 |
| 4.2.11 库检、簇的生成及测序 | 第87-88页 |
| 4.2.12 基因表达水平分析 | 第88页 |
| 4.2.13 GO和KEGG分析 | 第88-89页 |
| 4.3 结果 | 第89-101页 |
| 4.3.1 GT1和PRU虫株的GRA15基因的扩增 | 第89页 |
| 4.3.2 重组质粒的酶切验证 | 第89-90页 |
| 4.3.3 IFA鉴定GRA15蛋白在细胞内表达 | 第90-91页 |
| 4.3.4 WesternBlot验证GRA15蛋白在BHK-21细胞内的表达 | 第91-92页 |
| 4.3.5 RNA质量检测结果 | 第92-93页 |
| 4.3.6 测序数据质量情况汇总 | 第93-94页 |
| 4.3.7 Reads与参考基因组比对情况统计 | 第94页 |
| 4.3.8 基因表达水平 | 第94-95页 |
| 4.3.9 RNA-Seq相关性检查 | 第95-96页 |
| 4.3.10 基因差异表达分析 | 第96-97页 |
| 4.3.11 差异基因GO富集 | 第97-99页 |
| 4.3.12 差异基因KEGG分析 | 第99-101页 |
| 4.4 讨论 | 第101-104页 |
| 第五章 全文总结 | 第104-106页 |
| 5.1 结果与结论 | 第104页 |
| 5.1.1 弓形虫MIC6/7/8与宿主Spata3和Dkk2蛋白的互作分析 | 第104页 |
| 5.1.2 与弓形虫PRU虫株GRA15蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定 | 第104页 |
| 5.1.3 GT1和PRU虫株的GRA15蛋白对宿主细胞信号通路的影响 | 第104页 |
| 5.2 创新点 | 第104-105页 |
| 5.3 不足之处 | 第105页 |
| 5.4 展望 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-119页 |
| 附录1 本论文常用英文缩写 | 第119-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
| 个人简历 | 第122-123页 |
