| 中文摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-17页 |
| 1 前言 | 第18-35页 |
| 1.1 棉花枯萎病研究进展 | 第18-21页 |
| 1.1.1 棉花枯萎病概述 | 第18-19页 |
| 1.1.2 棉花的组织结构抗性 | 第19页 |
| 1.1.3 棉花的理化抗性 | 第19-20页 |
| 1.1.4 激素介导的抗性 | 第20-21页 |
| 1.2 MAPKs参与植物抗病反应 | 第21-29页 |
| 1.2.1 植物中的MAPK及分类 | 第21-24页 |
| 1.2.1.1 植物中的MAPKKK | 第21-22页 |
| 1.2.1.2 植物中的MKK | 第22-23页 |
| 1.2.1.3 植物中的MAPK | 第23-24页 |
| 1.2.2 MAPK级联途径参与植物抗病 | 第24-27页 |
| 1.2.2.1 SA诱导的MAPK级联途径参与调控植物抗病 | 第25-26页 |
| 1.2.2.2 JA诱导的MAPK级联途径参与调控植物抗病 | 第26页 |
| 1.2.2.3 ROS与MAPK级联途径在植物抗病过程中的关系 | 第26-27页 |
| 1.2.3 棉花中的抗病相关的MAPK级联途径的研究 | 第27-29页 |
| 1.3 植物MAPK信号传递的特异性 | 第29-33页 |
| 1.3.1 支架蛋白在MAPK级联途径中的作用 | 第29-30页 |
| 1.3.2 miRNA与MAPK | 第30-32页 |
| 1.3.3 促丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKPs) | 第32-33页 |
| 1.4 本研究的目的意义 | 第33-35页 |
| 2 材料与方法 | 第35-59页 |
| 2.1 实验材料 | 第35-38页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第35页 |
| 2.1.2 菌株与载体 | 第35页 |
| 2.1.3 酶及其他生化试剂 | 第35页 |
| 2.1.4 实验引物 | 第35-38页 |
| 2.2 实验方法 | 第38-59页 |
| 2.2.1 棉花幼苗的培养及处理 | 第38-39页 |
| 2.2.2 拟南芥的培养 | 第39-40页 |
| 2.2.3 植物总RNA的提取 | 第40-42页 |
| 2.2.3.1 利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取植物总RNA | 第40页 |
| 2.2.3.2 利用CTAB法提取棉花总RNA | 第40-41页 |
| 2.2.3.3 利用Trizol法提取本氏烟总RNA | 第41-42页 |
| 2.2.4 cDNA第一链的合成 | 第42页 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测目的基因的表达 | 第42-43页 |
| 2.2.6 植物基因组DNA的提取 | 第43-44页 |
| 2.2.6.1 CTAB法提取棉花基因组DNA | 第43页 |
| 2.2.6.2 小量法提取本氏烟基因组DNA | 第43-44页 |
| 2.2.7 目的基因序列的扩增 | 第44-45页 |
| 2.2.7.1 cDNA全长序列的扩增 | 第44-45页 |
| 2.2.7.2 启动子序列的扩增 | 第45页 |
| 2.2.8 琼脂糖凝胶电泳目的片段的回收 | 第45-46页 |
| 2.2.9 目的片段与克隆载体的连接 | 第46-47页 |
| 2.2.9.1 目的片段与pEasy-T3或pEasy-T1Simple克隆载体的连接 | 第46页 |
| 2.2.9.2 目的片段与pMD19-TSimple克隆载体连接 | 第46-47页 |
| 2.2.10 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化 | 第47-48页 |
| 2.2.10.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(简易法) | 第47页 |
| 2.2.10.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化 | 第47-48页 |
| 2.2.11 试剂盒法微量提取大肠杆菌质粒DNA | 第48页 |
| 2.2.12 限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒 | 第48-49页 |
| 2.2.13 植物表达载体的构建、转化及转基因烟草植株的获得 | 第49-52页 |
| 2.2.13.1 植物表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 2.2.13.2 农杆菌(LBA4404、GV3101)感受态细胞的制备 | 第50页 |
| 2.2.13.3 冻融法转化农杆菌感受态细胞 | 第50页 |
| 2.2.13.4 农杆菌介导的叶盘法转化本氏烟 | 第50-51页 |
| 2.2.13.5 转基因烟草植株的鉴定 | 第51-52页 |
| 2.2.14 病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术获得棉花基因沉默植株 | 第52页 |
| 2.2.14.1 农杆菌介导的基因瞬时表达 | 第52页 |
| 2.2.14.2 利用VIGS技术获得基因沉默的棉花植株 | 第52页 |
| 2.2.15 农杆菌介导的花序侵染法获得转启动子的拟南芥植株 | 第52-53页 |
| 2.2.15.1 农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥 | 第53页 |
| 2.2.15.2 转基因拟南芥的筛选鉴定 | 第53页 |
| 2.2.16 基因的亚细胞定位分析 | 第53页 |
| 2.2.17 植物总蛋白的提取及Westernblot检测目的基因的表达量 | 第53-55页 |
| 2.2.17.1 棉花总蛋白的提取 | 第54页 |
| 2.2.17.2 植物蛋白抽提试剂盒提取烟草总蛋白 | 第54页 |
| 2.2.17.3 基因的原核表达 | 第54-55页 |
| 2.2.17.4 抗体的制备 | 第55页 |
| 2.2.17.5 Westernblot检测目的基因的表达量 | 第55页 |
| 2.2.18 棉花枯萎病菌的抗病性分析 | 第55-56页 |
| 2.2.18.1 PDA培养基的配制 | 第55-56页 |
| 2.2.18.2 棉花枯萎病菌的培养 | 第56页 |
| 2.2.18.3 棉花枯萎病菌的离体接种实验 | 第56页 |
| 2.2.18.4 棉花枯萎病菌的活体接种实验 | 第56页 |
| 2.2.19 组织化学染色分析 | 第56-57页 |
| 2.2.19.1 转基因拟南芥GUS组织化学染色分析 | 第56页 |
| 2.2.19.2 3 ,3'-二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)染色 | 第56-57页 |
| 2.2.19.3 台盼蓝染色 | 第57页 |
| 2.2.20 酵母双杂交实验 | 第57页 |
| 2.2.21 双分子荧光互补实验 | 第57-58页 |
| 2.2.21.1 本氏烟叶片原生质体的制备 | 第57页 |
| 2.2.21.2 双分子荧光互补实验 | 第57-58页 |
| 2.2.22 网络资源及软件 | 第58-59页 |
| 2.2.22.1 网络资源及数据库 | 第58页 |
| 2.2.22.2 生物学软件 | 第58-59页 |
| 3 结果与分析 | 第59-95页 |
| 3.1 棉花GhMKK9基因的分离及生物信息学分析 | 第59-62页 |
| 3.1.1 GhMKK9全长cDNA序列分离及序列分析 | 第59-60页 |
| 3.1.2 GhMKK9氨基酸序列分析及其进化分析 | 第60-62页 |
| 3.2 GhMKK9的亚细胞定位分析 | 第62-63页 |
| 3.3 GhMKK9启动子的分离及启动子活性分析 | 第63-67页 |
| 3.3.1 GhMKK9启动子的分离及作用元件的预测 | 第63-66页 |
| 3.3.2 GhMKK9启动子活性分析 | 第66-67页 |
| 3.4 GhMKK9的表达特性分析 | 第67-69页 |
| 3.4.1 GhMKK9在mRNA水平上的表达特性分析 | 第67-68页 |
| 3.4.2 GhMKK9在蛋白水平上的表达特性分析 | 第68-69页 |
| 3.5 棉花GhMKK9沉默植株的获得及对棉花枯萎病菌的抗性分析 | 第69-73页 |
| 3.5.1 棉花GhMKK9沉默植株的获得 | 第69-70页 |
| 3.5.2 棉花GhMKK9沉默植株增加了对棉花枯萎病菌的抗性 | 第70-71页 |
| 3.5.3 棉花枯萎病菌侵染后棉花GhMKK9沉默植株抗性相关基因的表达分析 | 第71-72页 |
| 3.5.4 棉花枯萎病菌侵染后GhMKK9的沉默激活了沉默植株的抗氧化系统 | 第72-73页 |
| 3.6 GhMKK9超表达本氏烟植株的获得及对棉花枯萎病菌的抗性分析 | 第73-78页 |
| 3.6.1 GhMKK9超表达本氏烟植株的获得 | 第73-74页 |
| 3.6.2 GhMKK9超表达植株对棉花枯萎病菌的抗性分析 | 第74-77页 |
| 3.6.3 棉花枯萎病菌侵染后GhMKK9超表达植株抗性相关基因的表达分析 | 第77页 |
| 3.6.4 棉花枯萎病菌侵染后GhMKK9的超表达降低了植株抗氧化能力 | 第77-78页 |
| 3.7 GhMKK9和GhRaf19相互作用 | 第78-83页 |
| 3.7.1 GhRaf19序列分析及全长cDNA序列分离 | 第78-81页 |
| 3.7.2 GhRaf19的亚细胞定位分析 | 第81页 |
| 3.7.3 GhMKK9和GhRaf19相互作用 | 第81-83页 |
| 3.8 GhRaf19的表达特性分析 | 第83-85页 |
| 3.9 棉花GhRaf19沉默植株的获得及对棉花枯萎病菌的抗性分析 | 第85-89页 |
| 3.9.1 棉花GhRaf19沉默植株的获得 | 第85-86页 |
| 3.9.2 棉花GhRaf19沉默植株增加了对棉花枯萎病菌的抗性 | 第86-87页 |
| 3.9.3 棉花枯萎病菌侵染后棉花GhRaf19沉默植株抗性相关基因的表达分析 | 第87-88页 |
| 3.9.4 棉花枯萎病菌侵染后GhRaf19的沉默激活了沉默植株的抗氧化系统 | 第88-89页 |
| 3.10 GhRaf19超表达本氏烟植株的获得及对棉花枯萎病菌的抗性分析 | 第89-95页 |
| 3.10.1 GhRaf19超表达本氏烟植株的获得 | 第89-90页 |
| 3.10.2 GhRaf19超表达植株对棉花枯萎病菌的抗性分析 | 第90-93页 |
| 3.10.3 棉花枯萎病菌侵染后GhRaf19超表达植株抗性相关基因的表达分析 | 第93页 |
| 3.10.4 棉花枯萎病菌侵染后GhRaf19的超表达降低了植株抗氧化能力 | 第93-95页 |
| 4 讨论 | 第95-101页 |
| 4.1 棉花GhMKK9通过SA、JA和ROS信号途径来调控棉花抗枯萎病 | 第95页 |
| 4.2 GhMKK9负调控对棉花枯萎病菌的抗性 | 第95-96页 |
| 4.3 GhRaf19-GhMKK9级联途径负调控棉花抗枯萎病 | 第96-97页 |
| 4.4 GhRaf19-GhMKK9级联途径通过SA和JA信号途径来调控棉花抗枯萎病 | 第97-98页 |
| 4.5 GhMKK9和GhRaf19通过负调控ROS的产生来降低棉花对枯萎病菌的抗性 | 第98-99页 |
| 4.6 GhMKK9和GhRaf19参与到HR依赖的信号途径 | 第99-101页 |
| 5 结论 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 攻读学位期间发表的论文及成果 | 第114-115页 |
