| 中文摘要 | 第16-19页 |
| ABSTRACT | 第19-22页 |
| 符号说明 | 第23-25页 |
| 第一章 前言 | 第25-48页 |
| 1 抗肿瘤药物研发战略 | 第25-28页 |
| 1.1 新的细胞毒类药物 | 第25-27页 |
| 1.2 新靶点抗肿瘤药物研究 | 第27-28页 |
| 2 整合素与肿瘤转移 | 第28-37页 |
| 2.1 整合素结构 | 第28-30页 |
| 2.2 整合素在肿瘤转移过程中的作用 | 第30-37页 |
| 2.2.1 整合素对细胞存活的作用 | 第32页 |
| 2.2.2 整合素对细胞迁移的影响 | 第32-33页 |
| 2.2.3 整合素调节血管生成 | 第33-34页 |
| 2.2.4 整合素对肿瘤入侵与转移的影响 | 第34页 |
| 2.2.5 ECM—整合素相互作用成为癌症治疗的重要靶点 | 第34-37页 |
| 2.2.5.1 整合素抑制剂 | 第34-36页 |
| 2.2.5.2 基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂 | 第36-37页 |
| 3 动物毒素的抗肿瘤作用 | 第37-40页 |
| 3.1 斑蝥素(cantharidin,CA) | 第37页 |
| 3.2 多肽、蛋白质或酶类 | 第37-40页 |
| 3.2.1 蛇毒素去整合素(Disintegrins) | 第38页 |
| 3.2.2 蝎毒素Chlorotoxin(Cltx) | 第38-39页 |
| 3.2.3 蜂毒素(Melittin) | 第39页 |
| 3.2.4 海鞘多肽Didemnin B | 第39-40页 |
| 3.2.5 海兔多肽Dolastatin | 第40页 |
| 3.2.6 海兔蛋白Cyplasin | 第40页 |
| 4 中华真地鳖化学成分及药理作用研究进展 | 第40-46页 |
| 4.1 中华真地鳖活性成分 | 第41-43页 |
| 4.1.1 蛋白质(酶)和氨基酸 | 第41-42页 |
| 4.1.1.1 氨基酸 | 第41-42页 |
| 4.1.1.2 纤溶活性成分 | 第42页 |
| 4.1.1.3 抗肿瘤活性蛋白成分 | 第42页 |
| 4.1.2 脂肪酸 | 第42-43页 |
| 4.1.3 生物碱 | 第43页 |
| 4.1.4 脂溶性维生素和无机元素 | 第43页 |
| 4.1.5 高级醇及其衍生物 | 第43页 |
| 4.1.6 其他成分 | 第43页 |
| 4.2 中华真地鳖的药理作用 | 第43-46页 |
| 4.2.1 对心血管系统的影响 | 第44-45页 |
| 4.2.1.1 抗凝血和抗血栓作用 | 第44页 |
| 4.2.1.2 调节血脂、抗氧自由基及保护血管内皮细胞的作用 | 第44页 |
| 4.2.1.3 对血液流变性作用 | 第44-45页 |
| 4.2.1.4 抗缺血缺氧 | 第45页 |
| 4.2.2 抑制血管生成及抗肿瘤活性 | 第45页 |
| 4.2.3 抗突变作用 | 第45-46页 |
| 4.2.4 治疗骨折创伤作用 | 第46页 |
| 4.2.5 对免疫系统的影响及抗氧化作用 | 第46页 |
| 4.2.6 其他作用 | 第46页 |
| 5 本课题研究的目的和意义 | 第46-48页 |
| 第二章 中华真地鳖抗肿瘤蛋白分离纯化及鉴定 | 第48-72页 |
| 1 材料 | 第48-51页 |
| 1.1 实验材料及细胞 | 第48-49页 |
| 1.2 主要仪器设备及耗材 | 第49-50页 |
| 1.3 酶及主要试剂 | 第50-51页 |
| 2 实验方法 | 第51-60页 |
| 2.1 中华真地鳖抗肿瘤蛋白的分离纯化 | 第51-55页 |
| 2.1.1 蛋白粗提物的制备 | 第51页 |
| 2.1.2 抗肿瘤蛋白的纯化 | 第51-54页 |
| 2.1.2.1 CM-Sepharose FF弱阳离子交换色谱 | 第51-52页 |
| 2.1.2.2 DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换色谱 | 第52-53页 |
| 2.1.2.3 Q-Sepharose HP强阴离子交换色谱 | 第53页 |
| 2.1.2.4 Butyl Sepharose HP疏水相互作用色谱 | 第53-54页 |
| 2.1.2.5 Superdex 75凝胶过滤色谱 | 第54页 |
| 2.1.3 中华真地鳖抗肿瘤蛋白提取纯化流程 | 第54-55页 |
| 2.2 BCA法测定蛋白浓度 | 第55-56页 |
| 2.3 细胞培养 | 第56-57页 |
| 2.4 MTT法检测蛋白组分体外抗肿瘤活性 | 第57-58页 |
| 2.5 中华真地鳖抗肿瘤蛋白鉴定 | 第58-60页 |
| 2.5.1 SDS-PAGE鉴定蛋白纯度和表观分子量 | 第58-60页 |
| 2.5.2 质谱法测定分子质量 | 第60页 |
| 2.6 统计学处理 | 第60页 |
| 3 结果 | 第60-67页 |
| 3.1 中华真地鳖抗肿瘤蛋白的分离纯化 | 第60-65页 |
| 3.1.1 CM-Sepharose FF阳离子交换色谱结果 | 第60-61页 |
| 3.1.2 DEAE-Sepharose FF阴离子交换色谱结果 | 第61-62页 |
| 3.1.3 Q-Sepharose HP阴离子交换色谱结果 | 第62-63页 |
| 3.1.4 Butyl SepharoseHP疏水色谱结果 | 第63-64页 |
| 3.1.5 Superdex 75凝胶过滤色谱结果 | 第64-65页 |
| 3.2 中华真地鳖抗肿瘤蛋白鉴定 | 第65-66页 |
| 3.2.1 SDS-PAGE结果 | 第65页 |
| 3.2.2 MALDI-TOF-MS结果 | 第65-66页 |
| 3.3 中华真地鳖抗肿瘤蛋白得率 | 第66页 |
| 3.4 分离纯化过程中各活性组分体外抗肿瘤活性检测 | 第66-67页 |
| 4 讨论 | 第67-71页 |
| 5 本章小结 | 第71-72页 |
| 第三章 中华真地鳖抗肿瘤蛋白EPS72体外抗肿瘤方式研究 | 第72-96页 |
| 1 材料 | 第72-74页 |
| 1.1 细胞系 | 第72页 |
| 1.2 主要仪器设备及耗材 | 第72-73页 |
| 1.3 酶及主要试剂 | 第73-74页 |
| 1.4 主要试剂的配制 | 第74页 |
| 2 实验方法 | 第74-81页 |
| 2.1 细胞培养 | 第74页 |
| 2.2 MTT存活分析 | 第74-75页 |
| 2.2.1 EPS72抗瘤谱分析 | 第75页 |
| 2.2.2 EPS72对A549细胞增殖的影响 | 第75页 |
| 2.3 细胞形态学观察 | 第75页 |
| 2.4 台盼蓝染色计数 | 第75-76页 |
| 2.5 JC-1检测线粒体膜电位(△Ψm) | 第76-77页 |
| 2.6 AO/EB双荧光染色 | 第77-78页 |
| 2.7 细胞—基质粘附实验 | 第78-79页 |
| 2.8 细胞伸展实验 | 第79-80页 |
| 2.9 细胞迁移实验 | 第80页 |
| 2.10 细胞侵袭实验 | 第80-81页 |
| 2.11 统计学处理 | 第81页 |
| 3 结果 | 第81-93页 |
| 3.1 EPS72对体外培养肿瘤细胞及正常细胞的胞毒作用 | 第81-83页 |
| 3.2 EPS72对A549细胞增殖与存活的影响 | 第83-84页 |
| 3.3 EPS72对A549细胞形态学的影响 | 第84-85页 |
| 3.4 脱粘附细胞存活状态检测 | 第85-86页 |
| 3.4.1 台盼蓝染色结果 | 第85-86页 |
| 3.4.2 撤药重培养结果 | 第86页 |
| 3.5 EPS72进一步诱导A549细胞凋亡 | 第86-89页 |
| 3.5.1 JC-1检测线粒体膜电位(△Ψm)结果 | 第86-88页 |
| 3.5.2 AO/EB荧光染色结果 | 第88-89页 |
| 3.6 EPS72对A549细胞粘附的影响 | 第89-90页 |
| 3.7 EPS72对A549细胞伸展能力的影响 | 第90-92页 |
| 3.8 EPS72对肿瘤细胞迁移能力的影响 | 第92页 |
| 3.9 EPS72对肿瘤细胞侵袭能力的影响 | 第92-93页 |
| 4 讨论 | 第93-95页 |
| 5 本章小结 | 第95-96页 |
| 第四章 中华真地鳖抗肿瘤蛋白EPS72体外抗肿瘤作用分子机制的初步研究 | 第96-110页 |
| 1 材料 | 第96-98页 |
| 1.1 细胞系 | 第96页 |
| 1.2 主要仪器设备及耗材 | 第96-97页 |
| 1.3 酶及主要试剂 | 第97-98页 |
| 2 实验方法 | 第98-104页 |
| 2.1 微丝F-actin免疫荧光染色 | 第98-99页 |
| 2.2 流式细胞仪检测β1-整合素的表面表达 | 第99页 |
| 2.3 Western blotting分析β1-整合素和ILK细胞内表达情况 | 第99-104页 |
| 2.4 统计学分析 | 第104页 |
| 3 结果 | 第104-107页 |
| 3.1 EPS72诱导F-actin解聚 | 第104-105页 |
| 3.2 EPS72影响β1-整合素和ILK表达 | 第105-107页 |
| 4 讨论 | 第107-109页 |
| 5 本章小结 | 第109-110页 |
| 总结与展望 | 第110-112页 |
| 1 本研究的主要结论 | 第110页 |
| 2 展望 | 第110-112页 |
| 参考文献 | 第112-128页 |
| Article | 第128-136页 |
| 致谢 | 第136-137页 |
| 博士期间发表的论文 | 第137-138页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第138页 |
