| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 縮略语表 | 第10-11页 |
| 1. 前言 | 第11-27页 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌简介 | 第11-12页 |
| 1.2 芽胞的概述 | 第12-17页 |
| 1.2.1 芽胞的结构及其组成 | 第12-14页 |
| 1.2.2 芽胞的形成 | 第14-17页 |
| 1.2.2.1 芽胞的形成过程 | 第14-17页 |
| 1.2.2.2 芽胞形成的调控 | 第17页 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的概述 | 第17-21页 |
| 1.3.1 杀虫晶体蛋白的结构特征及其功能 | 第17-19页 |
| 1.3.2 杀虫晶体蛋白的定位和分类 | 第19-20页 |
| 1.3.3 杀虫晶体蛋白基因的表达调控 | 第20-21页 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体的形态及其形成过程 | 第21-23页 |
| 1.5 晶胞粘连现象的研究进展 | 第23-26页 |
| 1.6 晶胞粘连现象的研究目的和意义 | 第26-27页 |
| 2. 材料和方法 | 第27-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-40页 |
| 2.1.1 质粒、菌株和引物 | 第27-37页 |
| 2.1.2 培养基 | 第37页 |
| 2.1.3 抗生素及细菌培养温度 | 第37-38页 |
| 2.1.4 研究中用到的酶、抗体和试剂盒 | 第38页 |
| 2.1.5 实验试剂及配方 | 第38-39页 |
| 2.1.6 实验仪器 | 第39-40页 |
| 2.2 实验方法 | 第40-46页 |
| 2.2.1 DNA的常规操作 | 第40-43页 |
| 2.2.1.1 DNA的体外重组操作 | 第40页 |
| 2.2.1.2 PCR产物和酶切产物的回收 | 第40-41页 |
| 2.2.1.3 苏云金芽胞杆菌质粒DNA的制备 | 第41页 |
| 2.2.1.4 大肠杆菌质粒DNA的制备 | 第41页 |
| 2.2.1.5 苏云金芽胞杆菌总DNA的快速制备 | 第41-42页 |
| 2.2.1.6 大肠杆菌感受态的制备及氯化钙转化 | 第42页 |
| 2.2.1.7 苏云金芽胞杆菌感受态的制备及电转化 | 第42-43页 |
| 2.2.1.8 大肠杆菌转化子的筛选 | 第43页 |
| 2.2.1.9 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选 | 第43页 |
| 2.2.2 SOE-PCR | 第43-44页 |
| 2.2.3 利用质粒不相容原理消除内生大质粒法 | 第44页 |
| 2.2.4 晶体蛋白样的制备 | 第44页 |
| 2.2.5 His标签蛋白的纯化方法 | 第44-45页 |
| 2.2.6 GST标签蛋白的纯化方法 | 第45页 |
| 2.2.7 斑点杂交 | 第45-46页 |
| 3. 结果和分析 | 第46-74页 |
| 3.1 利用质粒不相容性消除YBT-020内生质粒pBMB28 | 第46-50页 |
| 3.1.1 消除了质粒pBMB28的突变株BMB1602的获得 | 第46-49页 |
| 3.1.1.1 含有外源质粒pRep28B重组菌的筛选 | 第46-47页 |
| 3.1.1.2 不含pBMB28但含pRep28B的突变株BMB1601的筛选 | 第47-48页 |
| 3.1.1.3 不含pBMB28和pRep28B的突变株BMB1602的筛选 | 第48-49页 |
| 3.1.2 突变株BMB1602不具有晶胞粘连现象 | 第49-50页 |
| 3.2 晶胞粘连必须因子ScaA、ScaB和Cry26Aa的相互作用研究 | 第50-54页 |
| 3.2.1 Cry26Aa-His、ScaA-GST、ScaB-GST融合蛋白的表达和纯化 | 第50-52页 |
| 3.2.1.1 表达载体的构建 | 第50-51页 |
| 3.2.1.2 融合蛋白的表达和纯化 | 第51-52页 |
| 3.2.2 Cry26Aa-His、ScaA-GST、ScaB-GST蛋白间相互作用的检测 | 第52-54页 |
| 3.2.2.1 Cry26Aa-His与ScaA-GST相互作用的检测 | 第52-53页 |
| 3.2.2.2 Cry26Aa-His、ScaA-GST、ScaB-GST三个蛋白共同相互作用的检测 | 第53-54页 |
| 3.3 其他类晶体蛋白不能在野生型YBT-020中形成晶胞粘连表型 | 第54-55页 |
| 3.4 Cry26Aa中与晶胞粘连现象相关的关键功能位点 | 第55-74页 |
| 3.4.1 Cry26Aa的氨基半段或羧基半段不能控制晶胞粘连现象 | 第55-60页 |
| 3.4.1.1 Cry26Aa、CrylCa、Cry7Ba的C/N半段分界点的确定 | 第56页 |
| 3.4.1.2 C/N半段互换载体的构建 | 第56-57页 |
| 3.4.1.3 互换重组蛋白在宿主菌BMBJ1中表达情况的检测 | 第57-58页 |
| 3.4.1.4 互换重组菌株晶胞表型的观察 | 第58-60页 |
| 3.4.2 Cry26Aa中与晶胞粘连现象相关的功能域分散在整个区域中 | 第60-69页 |
| 3.4.2.1 晶体蛋白Cry26Aa的氨基酸序列分析 | 第60-61页 |
| 3.4.2.2 氨基酸缺失载体的构建 | 第61页 |
| 3.4.2.3 氨基末端和羧基末端部分氨基酸与晶胞粘连现象有关 | 第61-64页 |
| 3.4.2.4 中间区域部分氨基酸与晶胞粘连现象有关 | 第64-66页 |
| 3.4.2.5 三个保守Domain处部分氨基酸与晶胞粘连现象有关 | 第66-69页 |
| 3.4.3 Cry26Aa第3-16位氨基酸中单个氨基酸的改变不影响粘连现象 | 第69-71页 |
| 3.4.3.1 点突变载体的构建 | 第69-70页 |
| 3.4.3.2 第3-16位氨基酸中单个氨基酸的改变不影响晶胞粘连现象的形成 | 第70-71页 |
| 3.4.4 晶体蛋白Cry26Aa三个保守Domain的空间结构分析 | 第71-74页 |
| 4. 讨论 | 第74-76页 |
| 4.1 粘连相关蛋白ScaA、ScaB、Cry26Aa之间不存在相互作用,晶体蛋白Cry26Aa可能通过与其他特殊芽胞因子发生互作而定位 | 第74-75页 |
| 4.2 Cry26Aa特殊的空间结构决定其能形成特殊的晶胞粘连现象 | 第75页 |
| 4.3 利用质粒不相容性原理可作为消除芽胞杆菌的内生大质粒的有效策略 | 第75-76页 |
| 5. 总结 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 发表文章 | 第84页 |
