| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 缩写表 | 第16-18页 |
| 合成小肽目录表 | 第18-22页 |
| 第一章 总论 | 第22-39页 |
| 1.1 TRAIL诱导的凋亡通路 | 第22-25页 |
| 1.1.1 外源途径 | 第23页 |
| 1.1.2 内源途径 | 第23-25页 |
| 1.2 序列比对 | 第25-29页 |
| 1.3 可行性推测 | 第29-30页 |
| 1.4 细胞调亡蛋白Procaspase-8 | 第30-33页 |
| 1.4.1 Procaspase-8的结构与作用 | 第30-31页 |
| 1.4.2 研究的目的与意义 | 第31-32页 |
| 1.4.3 本课题研究路线 | 第32-33页 |
| 1.5 细胞凋亡抑制蛋白c-FLIP | 第33-37页 |
| 1.5.1 c-FLIP的结构与作用 | 第33-34页 |
| 1.5.2 研究的目的与意义 | 第34-35页 |
| 1.5.3 本课题的研究路线 | 第35-37页 |
| 1.5.3.1 NCBI上c-FLIPs的序列 | 第35-36页 |
| 1.5.3.2 结构分析 | 第36-37页 |
| 1.6 多肽片段的合成 | 第37-39页 |
| 第二章 原核表达载体的构建 | 第39-71页 |
| 2.1 实验材料 | 第39-44页 |
| 2.1.1 菌种、载体和细胞 | 第39页 |
| 2.1.2 主要实验仪器与材料 | 第39-40页 |
| 2.1.3 主要实验药品 | 第40-41页 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 | 第41-44页 |
| 2.2 实验方法与步骤 | 第44-61页 |
| 2.2.1 目的序列的获取 | 第44-53页 |
| 2.2.1.1 procaspase-8和procaspase-8-DED的引物设计 | 第44-45页 |
| 2.2.1.2 c-FLIPs(180aa)引物设计 | 第45-46页 |
| 2.2.1.3 U2OS细胞的培养 | 第46-48页 |
| 2.2.1.4 U2OS细胞总RNA的提取 | 第48-49页 |
| 2.2.1.5 逆转录反应 | 第49-50页 |
| 2.2.1.6 PCR反应 | 第50-52页 |
| 2.2.1.7 PCR产物纯化 | 第52-53页 |
| 2.2.2 procaspase-8、procaspase-8-DED及c-FLIPs(180aa)克隆载体的构建 | 第53-60页 |
| 2.2.2.1 提取pET-28a(+)质粒 | 第53-54页 |
| 2.2.2.2 procaspase-8、procaspase-8-DED及c-FLIP(180aa)和pET-28a(+)的双酶切反应 | 第54-56页 |
| 2.2.2.3 切胶回收酶切后的procaspase-8、procaspase-8-DED及c-FLIPs(180aa)和线性化后的pET-28a(+) | 第56-57页 |
| 2.2.2.4 procaspase-8、procaspase-8-DED及c-FLIPs(180aa)与pET-28a(+)的连接反应 | 第57-58页 |
| 2.2.2.5 重组载体procaspase-8-pET-28a(+)、procaspase-8-DED-pET-28a(+)及c-FLIPs(180aa)-pET-28a(+)的转化 | 第58-59页 |
| 2.2.2.6 菌落PCR、酶切验证及测序保菌 | 第59-60页 |
| 2.2.3 原核表达菌株的构建 | 第60-61页 |
| 2.2.3.1 提取procaspase-8-pET-28a(+)、procaspase-8-DED-pET-28a(+)及c-FLIP(180aa)-pET-28a(+)质粒 | 第60页 |
| 2.2.3.2 procaspase-8-pET-28a(+)、procaspase-8-DED-pET-28a(+)及c-FLIP(180aa) -pET-28a(+)质粒的转化 | 第60页 |
| 2.2.3.3 菌落PCR、酶切验证及测序保菌 | 第60-61页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第61-71页 |
| 2.3.1 procaspase-8及procaspase-8-DED序列扩增结果 | 第61页 |
| 2.3.2 c-FLIPs(180aa)序列扩增结果 | 第61-62页 |
| 2.3.3 菌落PCR鉴定重组质粒procaspase-8-pET-28a(+)及procaspase-8-DED- pET-28a(+) | 第62-63页 |
| 2.3.4 菌落PCR鉴定重组质粒c-FLIPs(180aa)-pET-28a(+) | 第63-64页 |
| 2.3.5 酶切验证重组质粒procaspase-8-pET-28a(+)和procaspase-8-DED-pET-28a(+) | 第64-65页 |
| 2.3.6 酶切验证重组质粒c-FLIPs(180aa)-pET-28a(+) | 第65-66页 |
| 2.3.7 测序验证重组质粒procaspase-8-pET-28a(+)、procaspase-8-DED-pET-28a(+)和c-FLIPs(180aa)-pET28a(+) | 第66-71页 |
| 第三章 Procaspase-8、Procaspase-8-DED、c-FLIPs(180aa)蛋白的诱导表达 | 第71-88页 |
| 3.1 实验材料 | 第71-77页 |
| 3.1.1 菌种 | 第71页 |
| 3.1.2 主要实验仪器与材料 | 第71-73页 |
| 3.1.3 主要实验药品 | 第73-74页 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 | 第74-77页 |
| 3.2 实验方法与步骤 | 第77-83页 |
| 3.2.1 Procaspase-8和Procaspase-8-DED蛋白的诱导表达及诱导条件的筛选 | 第77-83页 |
| 3.2.1.1 考马斯亮蓝R250染色法 | 第77-81页 |
| 3.2.1.2 蛋白质印迹(Western Blot) | 第81-83页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第83-88页 |
| 3.3.1 Procaspase-8和Procaspase-8-DED诱导条件的筛选 | 第83-85页 |
| 3.3.2 c-FLIPs(180aa)诱导条件的筛选 | 第85-88页 |
| 第四章 Procaspase-8-DED和c-FLIPs(180aa)蛋白的纯化及浓缩 | 第88-101页 |
| 4.1 实验材料 | 第88-92页 |
| 4.1.1 菌种 | 第88页 |
| 4.1.2 主要实验仪器与材料 | 第88-89页 |
| 4.1.3 主要实验药品 | 第89-91页 |
| 4.1.4 主要试剂的配制 | 第91-92页 |
| 4.2 实验方法与步骤 | 第92-97页 |
| 4.2.1 利用镍柱纯化蛋白 | 第92-94页 |
| 4.2.1.1 蛋白的纯化 | 第92-94页 |
| 4.2.2 Procaspase-8-DED和c-FLIPs(180aa)纯化蛋白的浓缩 | 第94-97页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第97-101页 |
| 4.3.1 Procaspase-8-DED纯化检测结果 | 第97-98页 |
| 4.3.1.1 Procaspase-8-DED镍柱纯化结果 | 第97-98页 |
| 4.3.1.2 浓缩后蛋白的鉴定结果 | 第98页 |
| 4.3.2 c-FLIPs(180aa)纯化检测结果 | 第98-101页 |
| 4.3.2.1 c-FLIPs(180aa)镍柱纯化结果 | 第98-99页 |
| 4.3.2.2 浓缩后蛋白的鉴定结果 | 第99-101页 |
| 第五章 构建体外筛选体系 | 第101-124页 |
| 5.1 实验材料 | 第101-105页 |
| 5.1.1 主要实验仪器与材料 | 第101-102页 |
| 5.1.2 主要实验药品 | 第102-104页 |
| 5.1.3 主要试剂的配制 | 第104-105页 |
| 5.2 实验方法与步骤 | 第105-109页 |
| 5.2.1 亲和层析 | 第105-106页 |
| 5.2.2 亲和层析实验步骤 | 第106-109页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第109-124页 |
| 5.3.1 Procaspase-8-DED的亲和层析的实验结果 | 第109-113页 |
| 5.3.2 c-FLIPs(180aa)的亲和层析实验结果与讨论 | 第113-124页 |
| 5.3.1.1 验证实验 | 第113-115页 |
| 5.3.1.2 竞争实验 | 第115-122页 |
| 5.3.1.3 小肽活性汇总 | 第122-124页 |
| 第六章 相关蛋白的突变体的构建 | 第124-141页 |
| 6.1 实验材料 | 第124页 |
| 6.1.1 菌种、载体和细胞 | 第124页 |
| 6.1.2 实验仪器与材料 | 第124页 |
| 6.1.3 实验药品 | 第124页 |
| 6.1.4 试剂的配制 | 第124页 |
| 6.2 实验方法与步骤 | 第124-128页 |
| 6.2.1 引物的设计 | 第124-126页 |
| 6.2.2 U2OS细胞的培养 | 第126页 |
| 6.2.3 U2OS细胞总RNA的提取 | 第126页 |
| 6.2.4 逆转录反应 | 第126页 |
| 6.2.5 PCR反应 | 第126-128页 |
| 6.2.6 PCR产物纯化 | 第128页 |
| 6.3 平末端载体的构建 | 第128-132页 |
| 6.3.1 用pEASY-Blunt3 Clonin连接 | 第128-129页 |
| 6.3.2 FADD-Blunt3、c-FLIPs-Blunt3和procaspase-8-DED-Blunt3质粒的转化到DH5a中 | 第129-130页 |
| 6.3.3 菌落PCR及送样测序 | 第130-131页 |
| 6.3.4 点突变 | 第131-132页 |
| 6.4 实验结果与讨论 | 第132-141页 |
| 6.4.1 FADD、c-FLIPs、procaspase-8-DED序列扩增结果 | 第132-133页 |
| 6.4.2 菌落PCR鉴定重组质粒是否连接成功 | 第133-135页 |
| 6.4.3 测序验证重组质粒是否正确 | 第135-141页 |
| 第七章 实验总结 | 第141-144页 |
| 7.1 c-FLIPs专一性拮抗剂的研究结果 | 第141-142页 |
| 7.2 Procaspase-8与FADD的作用机制的实验结果 | 第142-144页 |
| 参考文献 | 第144-151页 |
| 致谢 | 第151-152页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表的论文目录 | 第152-153页 |
| 附录B 其他需要说明的内容 | 第153页 |
