| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 第一章 绪论 | 第16-35页 |
| 1.1 信号通路与癌症 | 第16-17页 |
| 1.2 Hedgehog信号通路 | 第17-22页 |
| 1.2.1 Hh信号通路的发现 | 第17页 |
| 1.2.2 Hh信号通路中的膜受体蛋白 | 第17-19页 |
| 1.2.3 Hh信号通路传递的主要成员 | 第19-21页 |
| 1.2.4 Hh信号通路对发育和疾病的影响 | 第21-22页 |
| 1.3 Gli/Ci转录因子蛋白家族 | 第22-26页 |
| 1.3.1 Gli/Ci蛋白的结构域 | 第22-24页 |
| 1.3.2 Hh信号调节Gli/Ci活化形式和抑制形式的平衡 | 第24-25页 |
| 1.3.3 哺乳动物系统中Gli蛋白的调控 | 第25-26页 |
| 1.4 Sufu蛋白的研究进展 | 第26-33页 |
| 1.4.1 sufu基因的发现 | 第26-27页 |
| 1.4.2 Sufu与Fu的相互作用 | 第27-28页 |
| 1.4.3 Sufu在调控哺乳动物Hh信号通路中起关键作用 | 第28-29页 |
| 1.4.4 Sufu调控Gli/Ci的方式 | 第29-30页 |
| 1.4.5 Sufu蛋白对肿瘤发生的抑制 | 第30-31页 |
| 1.4.6 Sufu蛋白的结构生物学研究 | 第31-33页 |
| 1.5 课题研究意义 | 第33-35页 |
| 第二章 Sufu蛋白的结构与功能研究 | 第35-88页 |
| 2.1 前言 | 第35-36页 |
| 2.2 实验材料 | 第36-39页 |
| 2.2.1 菌株和细胞系 | 第36页 |
| 2.2.2 基因的来源 | 第36-37页 |
| 2.2.3 质粒 | 第37-38页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第38-39页 |
| 2.3 实验方法 | 第39-54页 |
| 2.3.1 生物信息学分析 | 第39页 |
| 2.3.2 E.coli BL21(DE3) 表达系统 | 第39-40页 |
| 2.3.3 昆虫细胞表达系统 | 第40页 |
| 2.3.4 蛋白表达片段的选择 | 第40页 |
| 2.3.5 重组质粒的构建 | 第40-43页 |
| 2.3.6 琼脂糖凝胶电泳 | 第43页 |
| 2.3.7 SDS-PAGE | 第43-44页 |
| 2.3.8 常用试剂配制 | 第44-45页 |
| 2.3.9 基因删除突变的引入 | 第45-46页 |
| 2.3.10 E.coli BL21(DE3)中Sufu蛋白的表达 | 第46页 |
| 2.3.11 昆虫细胞培养 | 第46-47页 |
| 2.3.12 昆虫细胞中Sufu蛋白的表达 | 第47-48页 |
| 2.3.13 Sufu蛋白的纯化 | 第48-50页 |
| 2.3.14 蛋白的限制性酶切 | 第50页 |
| 2.3.15 蛋白质晶体生长 | 第50-51页 |
| 2.3.16 蛋白质甲基化 | 第51-52页 |
| 2.3.17 晶体优化的一般策略 | 第52页 |
| 2.3.18 晶体接种 | 第52-53页 |
| 2.3.19 晶体后处理 | 第53页 |
| 2.3.20 X-射线衍射数据收集和结构解析 | 第53-54页 |
| 2.3.21 NM分析 | 第54页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第54-87页 |
| 2.4.1 Sufu蛋白原核表达和纯化 | 第54-55页 |
| 2.4.2 Sufu蛋白昆虫细胞表达和纯化 | 第55-57页 |
| 2.4.3 Sufu蛋白保守性分析和折叠倾向性预测 | 第57-60页 |
| 2.4.4 Sufu蛋白的限制性酶切 | 第60-65页 |
| 2.4.5 Sufu中间删除突变体蛋白的表达与纯化 | 第65-67页 |
| 2.4.6 dSufu蛋白晶体生长与优化 | 第67-68页 |
| 2.4.7 hSufu蛋白晶体生长与优化 | 第68-70页 |
| 2.4.8 hSufu中间删除突变体蛋白晶体的生长与优化 | 第70-72页 |
| 2.4.9 晶体衍射数据收集和结构解析 | 第72-76页 |
| 2.4.10 hSufu的晶体结构 | 第76-78页 |
| 2.4.11 hSufu中间删除突变对Sufu的整体结构没有影响 | 第78-80页 |
| 2.4.12 hsufu的两个结构域之间的相互作用很少 | 第80页 |
| 2.4.13 hSufu的两个结构域之间存在构象变化 | 第80-81页 |
| 2.4.14 dSufu的晶体结构 | 第81-82页 |
| 2.4.15 hSufu和dSufu的结构比较 | 第82-84页 |
| 2.4.16 dSufu的两个结构域之间的相互作用 | 第84-85页 |
| 2.4.17 dSufu的两个结构域之间同样存在构象变化 | 第85-87页 |
| 2.5 本章小结 | 第87-88页 |
| 第三章 Sufu-Gli蛋白复合物的纯化与结构解析 | 第88-116页 |
| 3.1 前言 | 第88-89页 |
| 3.2 材料与方法 | 第89-94页 |
| 3.2.1 生物信息学分析 | 第89页 |
| 3.2.2 片段构建与纯化 | 第89页 |
| 3.2.3 阳离子交换层析 | 第89页 |
| 3.2.4 Ni~(2+)柱pull-down分析 | 第89页 |
| 3.2.5 Sufu和Gli蛋白的共表达 | 第89-90页 |
| 3.2.6 GST和Amylose柱蛋白纯化 | 第90页 |
| 3.2.7 表达载体的改造 | 第90-91页 |
| 3.2.8 多肽合成 | 第91页 |
| 3.2.9 Tricine SDS-PAGE | 第91-92页 |
| 3.2.10 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE） | 第92页 |
| 3.2.11 等温滴定微量量热检测（Isothermal titration calorimetry，ITC） | 第92-93页 |
| 3.2.12 hSufu-Gli蛋白复合物结晶 | 第93页 |
| 3.2.13 分子筛检测蛋白与蛋白相互作用 | 第93-94页 |
| 3.2.14 晶体衍射、数据收集和结构解析 | 第94页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第94-115页 |
| 3.3.1 Gli/Ci蛋白的折叠倾向性分析 | 第94-96页 |
| 3.3.2 Gli/Ci上N端结构域片段纯化摸索 | 第96-97页 |
| 3.3.3 Ci（200-375）与dSufu蛋白复合物的纯化 | 第97-99页 |
| 3.3.4 mGli1上能够结合hSufu的最短区域 | 第99-101页 |
| 3.3.5 Gli多肽的合成 | 第101-102页 |
| 3.3.6 hSufuΔ60和hGli1（97-143）的结合能力与FL hSufu一致 | 第102-104页 |
| 3.3.7 Gli多肽氨基酸序列越长其与hSufu的亲和力越强 | 第104-106页 |
| 3.3.8 Sufu/Gli蛋白复合物的晶体生长 | 第106-107页 |
| 3.3.9 hSufuΔ60-hGli1（112-128）蛋白复合物的结构解析 | 第107-110页 |
| 3.3.10 Sufu/Gli-NTD蛋白复合物的纯化 | 第110-115页 |
| 3.4 本章总结 | 第115-116页 |
| 第四章 Sufu-Gli蛋白复合物的结构与功能研究 | 第116-151页 |
| 4.1 前言 | 第116-117页 |
| 4.2 材料与方法 | 第117-122页 |
| 4.2.1 Consurf分析 | 第117页 |
| 4.2.2 突变质粒的构建 | 第117-118页 |
| 4.2.3 多肽的合成 | 第118页 |
| 4.2.4 ITC分析 | 第118页 |
| 4.2.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第118-119页 |
| 4.2.6 Tricine SDS-PAGE | 第119页 |
| 4.2.7 哺乳动物细胞培养和转染 | 第119页 |
| 4.2.8 荧光共振能量转移（FRET）分析 | 第119-120页 |
| 4.2.9 抗体 | 第120-121页 |
| 4.2.10 Western Blot分析 | 第121页 |
| 4.2.11 免疫共沉淀 | 第121页 |
| 4.2.12 荧光素酶报告基因分析 | 第121页 |
| 4.2.13 免疫荧光 | 第121-122页 |
| 4.2.14 细胞核组分的提取 | 第122页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第122-149页 |
| 4.3.1 hSufuΔ60-hGli1（112-128）蛋白复合物的整体结构 | 第122-123页 |
| 4.3.2 Gli的结合使得Sufu处于关闭状态 | 第123-124页 |
| 4.3.3 Sufu的构象变化受到Hh信号的调控 | 第124-126页 |
| 4.3.4 Sufu-NTD和CTD单独不能稳定结合hGli1（97-143） | 第126-128页 |
| 4.3.5 Sufu和Gli利用保守区域进行相互作用 | 第128-130页 |
| 4.3.6 Sufu-Gli的相互作用界面 | 第130-132页 |
| 4.3.7 Gli/Ci上关键氨基酸残基的突变破坏其与Sufu的结合 | 第132-134页 |
| 4.3.8 Sufu上关键氨基酸残基的突变破坏其与Gli的结合 | 第134-137页 |
| 4.3.9 Sufu和Gli的细胞定位 | 第137-139页 |
| 4.3.10 Sufu对于Gli/Ci的转录活性的调控 | 第139-140页 |
| 4.3.11 Sufu的突变使其失去保护Gli不被降解的作用 | 第140-141页 |
| 4.3.12 Sufu上高度保守区可能介导Sufu与其它蛋白的相互作用 | 第141-145页 |
| 4.3.13 肿瘤中发现的sufu突变对蛋白结构的影响 | 第145-147页 |
| 4.3.14 含“SYGHLS”基序蛋白并非都可以和Sufu发生相互作用 | 第147-149页 |
| 4.4 本章总结 | 第149-151页 |
| 第五章 总结与展望 | 第151-154页 |
| 参考文献 | 第154-172页 |
| 附录1 Sufu蛋白序列比对及标注 | 第172-174页 |
| 附录2 缩略词表 | 第174-175页 |
| 致谢 | 第175-176页 |
| 攻读博士期间发表论文 | 第176页 |
