| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 缩略词表 | 第13-16页 |
| 1 前言 | 第16-33页 |
| 1.1 人白细胞分化抗原CD20 | 第16-19页 |
| 1.1.1 CD20基因 | 第17页 |
| 1.1.2 CD20的分子结构 | 第17-19页 |
| 1.2 CD20生物学功能 | 第19-20页 |
| 1.2.1 调控细胞周期 | 第19-20页 |
| 1.2.2 钙离子通道 | 第20页 |
| 1.3 抗CD20单抗治疗NHL的效应机制 | 第20-22页 |
| 1.3.1 ADCC效应机制 | 第20-21页 |
| 1.3.2 CDC效应机制 | 第21-22页 |
| 1.3.3 其他作用机制 | 第22页 |
| 1.4 治疗性抗CD20单抗 | 第22-26页 |
| 1.4.1 鼠单克隆抗体McAb | 第22-23页 |
| 1.4.2 人鼠嵌合抗体Rituximab | 第23-25页 |
| 1.4.3 放射性免疫治疗药物Zevalin | 第25页 |
| 1.4.4 放射性免疫治疗药物Bexxar | 第25-26页 |
| 1.4.5 全人源化靶向抗C20单抗Ofatumumab | 第26页 |
| 1.5 定点整合 | 第26-31页 |
| 1.5.1 定点整合基本原理 | 第27-28页 |
| 1.5.2 定点整合载体 | 第28页 |
| 1.5.3 定点整合策略 | 第28-29页 |
| 1.5.4 定点整合筛选方式 | 第29-30页 |
| 1.5.5 定点整合技术的应用 | 第30-31页 |
| 1.6 本课题的设计思路 | 第31页 |
| 1.7 主要研究内容 | 第31-33页 |
| 2 实验材料与设备 | 第33-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第33-36页 |
| 2.1.1 质粒、细胞与菌株 | 第33-35页 |
| 2.1.2 细胞培养所需要的培养基等试剂 | 第35页 |
| 2.1.3 工具酶、试剂及试剂盒类 | 第35-36页 |
| 2.1.4 其他生化试剂 | 第36页 |
| 2.2 主要仪器装置 | 第36-38页 |
| 3 试验方法 | 第38-57页 |
| 3.1 常用培养基与缓冲液的配置 | 第38-39页 |
| 3.1.1 PBS缓冲液的配制 | 第38页 |
| 3.1.2 PB缓冲液的配制 | 第38页 |
| 3.1.3 TBE缓冲液的配制 | 第38页 |
| 3.1.4 青霉素 | 第38页 |
| 3.1.5 Inoue转化液的配制 | 第38页 |
| 3.1.6 LB培养基的配制 | 第38页 |
| 3.1.7 LB琼脂平板 | 第38-39页 |
| 3.1.8 SOB培养基 | 第39页 |
| 3.1.9 SOC培养基 | 第39页 |
| 3.1.10 Excell302培养基 | 第39页 |
| 3.2 细胞培养的常用技术和方法 | 第39-40页 |
| 3.2.1 常规细胞传代培养 | 第39页 |
| 3.2.2 细胞计数法 | 第39-40页 |
| 3.2.3 细胞复苏 | 第40页 |
| 3.2.4 细胞冻存 | 第40页 |
| 3.2.5 CHO/dhfr细胞培养的体系 | 第40页 |
| 3.3 质粒的扩增与提取 | 第40-43页 |
| 3.3.1 用Inoue法制备超级感受态细胞 | 第40-41页 |
| 3.3.2 质粒转化与扩增 | 第41-42页 |
| 3.3.3 质粒提取 | 第42页 |
| 3.3.4 从PCR反应液中回收PCR产物 | 第42-43页 |
| 3.3.5 琼脂糖凝胶回收DNA片段 | 第43页 |
| 3.4 目的引物的设计 | 第43-44页 |
| 3.5 扩增目的基因片段及目的基因片段的连接 | 第44-46页 |
| 3.5.1 扩增目的基因sp163-Lv,κC-κT-CMV,sp163-Hv,Hc-Fc | 第44-45页 |
| 3.5.2 胶回收PCR产物 | 第45页 |
| 3.5.3 Overlap PCR获得目的基因sp163-Lv-κC-κT-CMV和sp163-Hv-Hc-Fc | 第45-46页 |
| 3.5.4 胶回收PCR产物sC和sF | 第46页 |
| 3.6 pcDNA5/FRT-sC真核表达载体的构建 | 第46-49页 |
| 3.6.1 提取质粒pcDNA5/FRT | 第46-47页 |
| 3.6.2 Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ双酶切 | 第47页 |
| 3.6.3 定向克隆 | 第47-49页 |
| 3.7 构建嵌合抗CD20单抗真核表达载体pcDNA5/FRT-sC-sF | 第49-50页 |
| 3.7.1 EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切 | 第49页 |
| 3.7.2 定向克隆 | 第49-50页 |
| 3.8 定点整合FRTCHO工程细胞株的构建 | 第50-53页 |
| 3.8.1 提取pFRT/lacZeo-dhfr质粒 | 第50页 |
| 3.8.2 Eco O109I酶切pFRT/lacZeo-dhfr | 第50-51页 |
| 3.8.3 准备CHO/dhfr-细胞 | 第51页 |
| 3.8.4 线性化pFRT/lacZeo-dhfr质粒转染CHO/dhfr~-细胞 | 第51-53页 |
| 3.9 稳定、高表达抗CD20单抗CHO-CD20工程细胞株的构建 | 第53-57页 |
| 3.9.1 提取质粒 | 第53页 |
| 3.9.2 pcDNA5/FRT-sC-sF和pOG44质粒共转染FRT CHO细胞 | 第53-54页 |
| 3.9.3 抗性克隆的筛选 | 第54-55页 |
| 3.9.4 MTX加压筛选高表达单克隆细胞株 | 第55页 |
| 3.9.5 Zeocin致敏试验 | 第55-56页 |
| 3.9.6 CHO-CD20单克隆细胞的无血清驯化 | 第56页 |
| 3.9.7 CHO-CD20嵌合抗体样品的纯化 | 第56-57页 |
| 4 CHO-CD20表达产物初步质量研究 | 第57-59页 |
| 4.1 分子量和纯度 | 第57页 |
| 4.1.1 SDS—PAGE凝胶电泳 | 第57页 |
| 4.1.2 SEC—HPLC色谱检测纯度 | 第57页 |
| 4.2 FACS检测抗体抗原结合活性 | 第57-58页 |
| 4.3 比活 | 第58-59页 |
| 5 结果与分析 | 第59-74页 |
| 5.1 载体构建 | 第59-64页 |
| 5.1.1 目的基因PCR片段的琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第59-60页 |
| 5.1.2 Overlap PCR目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第60页 |
| 5.1.3 菌落PCR验证pcDNA5/FRT-sC | 第60-61页 |
| 5.1.4 双酶切验证pcDNA5/FRT-sC质粒 | 第61-62页 |
| 5.1.5 pcDNA5/FRT-sC质粒sC片段的测序 | 第62页 |
| 5.1.6 菌落PCR验证pcDNA5/FRT-sC-sF | 第62-63页 |
| 5.1.7 双酶切验证pcDNA5/FRT-sC-sF质粒 | 第63-64页 |
| 5.1.8 pcDNA5/FRT-sC-sF质粒sF片段的测序 | 第64页 |
| 5.2 定点整合FRTCHO工程细胞株的构建 | 第64-66页 |
| 5.2.1 MTX加压前Zeocin抗性克隆β-Gal表达量 | 第64-65页 |
| 5.2.2 MTX加压后β-Gal表达量 | 第65-66页 |
| 5.3 稳定、高表达抗CD20单抗CHO-CD20工程细胞株的构建 | 第66-69页 |
| 5.3.1 转染后潮霉素B抗性克隆的筛选 | 第66-67页 |
| 5.3.2 加压前单克隆目的蛋白表达量 | 第67-68页 |
| 5.3.3 Zeocin致敏试验 | 第68页 |
| 5.3.4 梯度加压后蛋白表达量 | 第68-69页 |
| 5.3.5 无血清驯化 | 第69页 |
| 5.3.6 嵌合抗体样品的纯化 | 第69页 |
| 5.4 表达产物初步质量研究 | 第69-74页 |
| 5.4.1 SDS-PAGE电泳结果 | 第69-70页 |
| 5.4.2 SEC-HPLC色谱检测结果 | 第70-71页 |
| 5.4.3 FACS检测抗体抗原结合活性 | 第71-72页 |
| 5.4.4 表达产物比活 | 第72-74页 |
| 讨论 | 第74-78页 |
| 结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-83页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
