| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 前言 | 第11-18页 |
| 第一部分 重组腺病毒pAd-NSP4-VP7的构建及体外表达检测 | 第18-50页 |
| 一、实验材料和方法 | 第19-38页 |
| (一) 实验材料 | 第19-21页 |
| 1. 细胞、质粒和病毒 | 第19页 |
| 2. 主要抗体、试剂 | 第19-20页 |
| 3. 主要仪器 | 第20-21页 |
| (二) 实验方法 | 第21-38页 |
| 1. 人源轮状病毒ZTR-68的分离与鉴定 | 第21页 |
| 2. 目的基因NSP4、VP7的扩增 | 第21-23页 |
| 3. 重组质粒pcDNA3.0BA-NSP4-VP7的构建 | 第23-27页 |
| 4. 穿梭质粒pshuttle-NSP4-VP7及pshuttle-NSP4、pshuttle-VP7的构建 | 第27-30页 |
| 5. 重组腺病毒的构建 | 第30-32页 |
| 6. 重组腺病毒的包装 | 第32-35页 |
| 7. 电镜观察重组腺病毒感染Ad293细胞及的病毒颗粒形态观察 | 第35-36页 |
| 8. 目的基因NSP4、VP7体外表达的检测 | 第36-38页 |
| 二、实验结果与分析 | 第38-46页 |
| (一) 重组质粒pcDNA3.0BA-NSP4-VP7的构建与鉴定 | 第38-40页 |
| 1. RT-PCR扩增NSP4和VP7基因 | 第38-39页 |
| 2. 重组质粒pcDNA3.0A-VP7的构建及鉴定 | 第39页 |
| 3.重组质粒pcDNA3.0BA-NSP4-VP7的构建及鉴定 | 第39-40页 |
| (二) 重组腺病毒rAd-NSP4-VP7的构建与鉴定 | 第40-44页 |
| 1. PCR扩增NSP4-polyA-CMV-VP7基因片段 | 第40-41页 |
| 2. 重组穿梭质粒pshuttle -NSP4-VP7、pshuttle-NSP4和pshuttle-VP7的鉴定 | 第41-42页 |
| 3. 重组质粒pAd-NSP4-VP7和pAd-NSP4、pAd-VP7同源重组的筛选 | 第42页 |
| 4. 重组腺病毒包装致Ad293细胞病变的观察 | 第42-43页 |
| 5. 电镜观察重组腺病毒的形态学及在Ad293细胞中的感染情况 | 第43-44页 |
| (三) 重组腺病毒rAd-NSP4-VP7和rAd-NSP4、rAd-VP7的体外转录表达检测 | 第44-46页 |
| 1. RT-PCR检测NSP4和VP7基因在Vero细胞中的转录 | 第44-45页 |
| 2. 间接免疫荧光检测NSP4和VP7基因在Vero细胞中的表达 | 第45-46页 |
| 3. Western Blot检测NSP4和VP7基因在Vero细胞中的表达 | 第46页 |
| 三、讨论 | 第46-50页 |
| 第二部分 重组腺病毒pAd-NSP4-VP7免疫小鼠的免疫原性评价 | 第50-76页 |
| 一、实验材料和方法 | 第50-58页 |
| (一) 实验材料 | 第50-52页 |
| 1. 病毒和细胞 | 第50-51页 |
| 2. 实验动物 | 第51页 |
| 3. 主要抗体、试剂 | 第51页 |
| 4. 主要仪器 | 第51-52页 |
| (二) 实验方法 | 第52-58页 |
| 1. 重组腺病毒的传代扩增 | 第52页 |
| 2. 重组腺病毒rAd-NSP4、rAd-VP7和rAd-NSP4-VP7滴度的测定 | 第52-54页 |
| 3. ICR小鼠免疫方案 | 第54页 |
| 4. 免疫小鼠的血清学检测 | 第54-56页 |
| 5. 免疫小鼠的细胞学检测 | 第56-58页 |
| 6. 对数据进行统计分析 | 第58页 |
| 二、实验结果与分析 | 第58-72页 |
| (一) 重组腺病毒各代次的滴度测定 | 第58-62页 |
| 1. 重组腺病毒的传代及致Ad293细胞病变的观察 | 第58-59页 |
| 2. CCID50法测定重组腺病毒的滴度 | 第59-61页 |
| 3. 蚀斑法测定重组腺病毒的滴度 | 第61-62页 |
| (二) 重组腺病毒诱导小鼠产生的体液免疫反应 | 第62-67页 |
| 1. 不同时段免疫小鼠抗轮状病毒特异性血清IgG效价 | 第62-64页 |
| 2. 二次免疫后小鼠抗轮状病毒特异性血清IgA效价 | 第64-65页 |
| 3. 免疫小鼠血清中和抗体滴度 | 第65-66页 |
| 4. 免疫小鼠肠道分泌性IgA抗体滴度 | 第66-67页 |
| (二) 重组腺病毒诱导小鼠产生的细胞免疫反应 | 第67-72页 |
| 1. 流式细胞术检测免疫小鼠脾淋巴细胞亚群构成比情况 | 第67-70页 |
| 2. ELISPOT检测免疫小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-4的情况 | 第70-72页 |
| 三、讨论 | 第72-76页 |
| 第三部分 轮状病毒乳鼠感染模型的建立及rAd-NSP4-VP7疫苗对其免疫保护效果评价 | 第76-90页 |
| 一、实验材料和方法 | 第77-83页 |
| (一) 实验材料 | 第77-78页 |
| 1. 病毒和细胞 | 第77页 |
| 2. 实验动物 | 第77页 |
| 3. 主要抗体、试剂 | 第77页 |
| 4. 主要仪器 | 第77-78页 |
| (二) 实验方法 | 第78-83页 |
| 1. 轮状病毒的培养传代及收获 | 第78-80页 |
| 2. 轮状病毒感染乳鼠动物模型建立 | 第80-82页 |
| 3. rAd-NSP4-VP7疫苗对BALB/c乳鼠免疫保护效果评价 | 第82-83页 |
| 二、实验结果与分析 | 第83-87页 |
| (一) ZTR-68株轮状病毒感染性滴度的测定 | 第83页 |
| (二) 乳鼠口服接种RV后的症状观察和排毒检测 | 第83-86页 |
| 1. 腹泻评分与腹泻百分数 | 第83-84页 |
| 2. 乳鼠粪便排毒阳性率检测 | 第84-85页 |
| 3. 乳鼠空肠病理切片观察 | 第85-86页 |
| (三) rAd-NSP4-VP7接种ICR孕鼠后对乳鼠抗RV被动免疫保护效果评价 | 第86-87页 |
| 三、讨论 | 第87-90页 |
| 小结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-99页 |
| 附录 | 第99-110页 |
| 论文综述 | 第110-118页 |
| 参考文献 | 第115-118页 |
| 致谢 | 第118-119页 |
| 研究生简历 | 第119-120页 |
