| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 一、引言 | 第14-24页 |
| 1.1 植物细胞壁 | 第14-20页 |
| 1.1.1 纤维素的生物合成 | 第15-16页 |
| 1.1.2 木质素的生物合成 | 第16-17页 |
| 1.1.3 半纤维素的生物合成 | 第17-18页 |
| 1.1.4 次生壁的沉积调控模式 | 第18-20页 |
| 1.2 MYB转录因子研究进展 | 第20-22页 |
| 1.2.1 MYB转录因子的发现、结构及其功能 | 第20页 |
| 1.2.2 R2R3 MYB调控次生壁的研究 | 第20-21页 |
| 1.2.3 R2R3 MYB调控次生壁的方式 | 第21-22页 |
| 1.3 立体依据及研究意义 | 第22-24页 |
| 二、实验材料 | 第24-30页 |
| 2.1 植物材料 | 第24页 |
| 2.2 载体及菌种 | 第24页 |
| 2.3 化学试剂 | 第24页 |
| 2.4 工具酶 | 第24页 |
| 2.5 试剂盒 | 第24-25页 |
| 2.6 常用储液 | 第25页 |
| 2.7 常用缓冲液和提取缓冲液 | 第25-27页 |
| 2.8 培养基 | 第27-29页 |
| 2.9 PCR反应引物合成和DNA测序 | 第29页 |
| 2.10 仪器设备 | 第29-30页 |
| 三、实验方案 | 第30-41页 |
| 3.1 基因的分离与序列分析 | 第30页 |
| 3.2 棉花基因的组织表达图谱分析 | 第30-32页 |
| 3.2.1 棉花各组织和纤维发育不同时期材料的获取 | 第30页 |
| 3.2.2 棉花材料RNA提取 | 第30-31页 |
| 3.2.3 DNase处理去除RNA中的基因组DNA | 第31页 |
| 3.2.4 RNA逆转录为cDNA | 第31页 |
| 3.2.5 PCR检测逆转录cDNA的质量 | 第31页 |
| 3.2.6 RT-PCR分析基因的表达模式 | 第31-32页 |
| 3.3 启动子活性分析 | 第32-34页 |
| 3.3.1 高盐低渗法提取棉花gDNA | 第32页 |
| 3.3.2 启动子的分离 | 第32-33页 |
| 3.3.3 Promoter::GUS重组质粒的构建 | 第33页 |
| 3.3.4 Promoter::GUS重组质粒电转至农杆菌GV3101 | 第33页 |
| 3.3.5 转基因拟南芥的获取 | 第33-34页 |
| 3.3.6 染色分析GUS报告基因活性 | 第34页 |
| 3.4 蛋白亚细胞定位 | 第34-35页 |
| 3.4.1 eGFP融合表达载体的构建 | 第34页 |
| 3.4.2 拟南芥中分析棉花基因的亚细胞定位 | 第34-35页 |
| 3.5 酵母体内分析蛋白的转录激活 | 第35-36页 |
| 3.5.1 酵母转化 | 第35页 |
| 3.5.2 自激活检测 | 第35-36页 |
| 3.6 转基因拟南芥切片分析 | 第36-37页 |
| 3.6.1 徒手切片 | 第36页 |
| 3.6.2 石蜡切片 | 第36页 |
| 3.6.3 细胞壁厚度统计 | 第36页 |
| 3.6.4 CBM3a标记的免疫组化 | 第36-37页 |
| 3.7 细胞壁组分纤维素含量测定 | 第37页 |
| 3.8 拟南芥中次生壁生物合成相关基因的表达分析 | 第37-38页 |
| 3.9 酵母单杂交验证直接作用的下游靶基因启动子 | 第38页 |
| 3.10 蛋白原核表达及兔多克隆抗体的制备 | 第38-40页 |
| 3.10.1 蛋白诱导 | 第38页 |
| 3.10.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE | 第38-39页 |
| 3.10.3 组氨酸标签融合蛋白纯化操作(变性纯化) | 第39页 |
| 3.10.4 Western Blot | 第39-40页 |
| 3.10.5 兔多克隆抗体的制备 | 第40页 |
| 3.10.6 家兔多克隆抗体检测棉花中的蛋白 | 第40页 |
| 3.11 转基因棉花遗传转化 | 第40-41页 |
| 四、实验结果 | 第41-62页 |
| 4.1 GhMYB7与拟南芥AtMYB26及AtMYB103存在较高同源性 | 第41-42页 |
| 4.2 GhMYB7在纤维发育阶段优势表达 | 第42-43页 |
| 4.3 GhMYB7启动子在拟南芥中特异地表达于表皮毛中 | 第43页 |
| 4.4 GhMYB7定位于细胞核 | 第43-44页 |
| 4.5 GhMYB7具有酵母自激活性 | 第44-45页 |
| 4.6 GhMYB7过表达转基因拟南芥的获取 | 第45页 |
| 4.7 GhMYB7过表达转基因拟南芥出现矮化及发育迟缓外部表型 | 第45-46页 |
| 4.8 徒手切片分析GhMYB7过表达导致的异位沉积 | 第46-48页 |
| 4.9 GhMYB7过表达导致花序茎及主根次生壁厚度增加和次生壁物质异位沉积 | 第48-50页 |
| 4.10 GhMYB7过表达导致了花序茎细胞壁结晶纤维素含量的增加 | 第50-51页 |
| 4.11 GhMYB7过表达激活了一整套次生壁合成基因以及相关转录因子的表达 | 第51-52页 |
| 4.12 GhMYB7直接结合拟南芥SND1和CesA4基因启动子 | 第52-55页 |
| 4.13 GhMYB7过表达拟南芥增加了对纤维素特异性染料的耐受性 | 第55页 |
| 4.14 大肠杆菌中表达GhMYB7蛋白 | 第55-58页 |
| 4.15 GhMYB7家兔多克隆抗体的制备 | 第58-60页 |
| 4.16 GhMYB7转基因棉花的获取及鉴定 | 第60-62页 |
| 4.16.1 GhMYB7过量表达转基因棉花 | 第60页 |
| 4.16.2 GhMYB7-RNAi转基因棉花 | 第60-62页 |
| 五、讨论 | 第62-65页 |
| 参考文献 | 第65-69页 |
| 附录 | 第69-72页 |
| 附录1 缩写词 | 第69-70页 |
| 附录2 载体示意图 | 第70-72页 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
