| 中文摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 英文缩写表 | 第7-12页 |
| 1 引言 | 第12-21页 |
| 1.1 猪圆环病毒2型致病机制的国内外研究概况 | 第12-14页 |
| 1.1.1 致病机理 | 第12-14页 |
| 1.1.2 持续性感染 | 第14页 |
| 1.2 调节性T细胞的研究现状与发展动态 | 第14-18页 |
| 1.2.1 CD4+CD25+调节性T细胞的发现与其产生、分化 | 第15页 |
| 1.2.2 CD4+CD25+调节性T细胞的分子标志及作用机制 | 第15-16页 |
| 1.2.3 CD4+CD25+调节性T细胞与感染性疾病间的关系 | 第16-17页 |
| 1.2.4 CD4+CD25+调节性T细胞在病原体感染疾病免疫领域的前景展望 | 第17-18页 |
| 1.3 研究内容和技术路线 | 第18-19页 |
| 1.3.1 研究内容 | 第18-19页 |
| 1.3.2 技术路线（见下页） | 第19页 |
| 1.4 研究目的与意义 | 第19页 |
| 1.5 研究目标 | 第19-20页 |
| 技术路线 | 第20-21页 |
| 2 材料 | 第21-25页 |
| 2.1 病毒与细胞 | 第21页 |
| 2.2 实验动物 | 第21页 |
| 2.3 抗体与试剂盒 | 第21-22页 |
| 2.3.1 流式细胞术检测用标记抗体 | 第21页 |
| 2.3.2 小鼠细胞因子检测用ELISA试剂盒 | 第21-22页 |
| 2.4 试剂 | 第22-24页 |
| 2.4.1 培养细胞用溶液 | 第22页 |
| 2.4.2 DNA与RNA提取用试剂 | 第22-23页 |
| 2.4.3 琼脂糖凝胶电泳用溶液 | 第23页 |
| 2.4.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化用试剂 | 第23页 |
| 2.4.5 脾细胞分离及脾淋巴细胞增殖实验用溶液 | 第23页 |
| 2.4.6 组织切片及免疫组化用试剂 | 第23-24页 |
| 2.4.7 其他试剂 | 第24页 |
| 2.5 主要仪器 | 第24-25页 |
| 3 方法 | 第25-36页 |
| 3.1 PCR用引物的设计与合成 | 第25页 |
| 3.2 实时荧光定量PCR标准曲线的建立 | 第25-28页 |
| 3.2.1 脾细胞的获取 | 第25-26页 |
| 3.2.2 尼龙毛法分离T淋巴细胞 | 第26页 |
| 3.2.3 肝脏、肺脏组织悬液的制备 | 第26页 |
| 3.2.4 细胞、组织中总RNA提取 | 第26页 |
| 3.2.5 总RNA的反转录与PCR | 第26-27页 |
| 3.2.6 目的基因PCR产物的纯化和回收 | 第27页 |
| 3.2.7 目的基因和pGM-T载体的连接 | 第27页 |
| 3.2.8 连接产物的转化 | 第27页 |
| 3.2.9 重组质粒DNA的提取 | 第27-28页 |
| 3.2.10 重组质粒序列测定 | 第28页 |
| 3.2.11 Foxp3、β-actin、PCV2 基因实时荧光定量PCR标准曲线的建立 | 第28页 |
| 3.3 FOXP3 真核重组表达质粒的构建与鉴定 | 第28-30页 |
| 3.3.1 小鼠Foxp3 全基因的扩增 | 第28-29页 |
| 3.3.2 小鼠Foxp3 基因真核表达载体的构建与鉴定 | 第29-30页 |
| 3.3.3 pcDNA3.1-Foxp3 质粒在小鼠体内的表达检测 | 第30页 |
| 3.4 FOXP3 基因SHRNA的合成及筛选 | 第30-31页 |
| 3.4.1 shRNA合成 | 第30-31页 |
| 3.4.2 shRNA表达质粒干扰活性的鉴定 | 第31页 |
| 3.5 动物实验分组及感染 | 第31-32页 |
| 3.6 血清、组织中PCV2 核酸的定量检测 | 第32页 |
| 3.7 脾淋巴细胞增殖试验 | 第32-33页 |
| 3.7.1 CD4+T和CD8+T细胞的分选 | 第32-33页 |
| 3.7.2 CD4+CD25+ T细胞分选 | 第33页 |
| 3.7.3 CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD25+ T细胞增殖实验 | 第33页 |
| 3.8 脾淋巴细胞中不同细胞亚群的测定 | 第33页 |
| 3.9 血清中细胞因子检测 | 第33-34页 |
| 3.10 脾脏中FOXP3 基因的定量检测 | 第34页 |
| 3.11 组织中PCV2、FOXP3 的免疫组化检测 | 第34-35页 |
| 3.11.1 病料的采集与固定 | 第34页 |
| 3.11.2 石蜡切片的制作 | 第34-35页 |
| 3.11.3 免疫组化 | 第35页 |
| 3.12 数据表示和统计分析 | 第35-36页 |
| 4 实验结果 | 第36-55页 |
| 4.1 FOXP3 基因和内参基因 Β-ACTIN目的片段的重组质粒的鉴定 | 第36页 |
| 4.2 FOXP3、Β-ACTIN、PCV2 基因目的片段标准曲线的建立 | 第36-37页 |
| 4.3 表达小鼠FOXP3 的真核表达载体 | 第37-39页 |
| 4.3.1 小鼠Foxp3 全基因的PCR扩增与克隆载体 | 第37-38页 |
| 4.3.2 小鼠Foxp3 基因表达载体pcDNA3.1-Foxp3 | 第38-39页 |
| 4.3.3 重组质粒pcDNA3.1-Foxp3 在小鼠体内的的表达 | 第39页 |
| 4.4 FOXP3-SHRNA表达质粒的干扰活性 | 第39-40页 |
| 4.5 脾脏FOXP3 基因的表达水平 | 第40-41页 |
| 4.6 小鼠血清、脾细胞中的PCV2 核酸载量 | 第41-43页 |
| 4.6.1 小鼠血清中的PCV2 核酸载量 | 第41-42页 |
| 4.6.2 小鼠脾细胞中PCV2 的核酸载量 | 第42-43页 |
| 4.7 免疫组化检测小鼠肺脏中PCV2 抗原分布 | 第43-44页 |
| 4.8 小鼠脾淋巴细胞增殖活性 | 第44-48页 |
| 4.9 血清细胞因子的表达水平 | 第48-50页 |
| 4.10 脾细胞中不同淋巴细胞亚群的变化 | 第50-55页 |
| 4.10.1 CD3+CD4+CD8- T细胞亚群含量的动态变化 | 第50-51页 |
| 4.10.2 CD3+CD4-CD8+ T细胞亚群含量的动态变化 | 第51-52页 |
| 4.10.3 CD3+CD4+CD8+ T细胞亚群含量的动态变化 | 第52页 |
| 4.10.4 CD3-CD4-CD8+细胞亚群含量的动态变化 | 第52-53页 |
| 4.10.5 CD4+CD25+CD127Low调节性T细胞亚群含量的动态变化 | 第53-55页 |
| 5 讨论 | 第55-59页 |
| 5.1 实时荧光定量PCR标准曲线的建立 | 第55页 |
| 5.2 CD4+CD25+调节性T细胞与FOXP3 | 第55-56页 |
| 5.3 CD4+CD25+调节性T细胞对PCV2 增殖的影响 | 第56页 |
| 5.4 PCV2 感染对小鼠脾脏中细胞增殖能力的影响 | 第56-57页 |
| 5.5 PCV2 感染对细胞因子水平的影响 | 第57页 |
| 5.6 PCV2 感染对T细胞亚群含量变化的影响 | 第57-59页 |
| 6 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 在读期间发表的学术论文与获得的研究成果 | 第65-66页 |
| 作者简介 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 附录 | 第68-70页 |
