| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 文献综述 | 第9-14页 |
| 1.1 稻瘟病概况 | 第9页 |
| 1.2 功能基因研究方法 | 第9-10页 |
| 1.2.1 RNA干扰 | 第9页 |
| 1.2.2 基因敲除 | 第9-10页 |
| 1.3 载体构建方法 | 第10-11页 |
| 1.3.1 重叠延伸PCR方法 | 第10页 |
| 1.3.2 连接介导PCR法 | 第10页 |
| 1.3.3 Gateway重组法 | 第10页 |
| 1.3.4 酵母重组法 | 第10-11页 |
| 1.4 转化方法 | 第11-12页 |
| 1.4.1 原生质体转化法 | 第11页 |
| 1.4.2 限制性内切酶介导法（REMI） | 第11页 |
| 1.4.3 基因枪法 | 第11页 |
| 1.4.4 农杆菌介导的转化方法 | 第11-12页 |
| 1.5 转基因表达差异 | 第12页 |
| 1.5.1 外源基因插入拷贝数 | 第12页 |
| 1.5.2 RNA沉默 | 第12页 |
| 1.5.3 位置效应 | 第12页 |
| 1.6 基因定点整合技术 | 第12-13页 |
| 1.7 琥珀酸脱氢酶抑制剂 | 第13-14页 |
| 2 引言 | 第14-15页 |
| 3 材料与方法 | 第15-26页 |
| 3.1 供试菌株 | 第15页 |
| 3.2 供试培养基 | 第15页 |
| 3.3 供试菌株活化及培养 | 第15页 |
| 3.4 稻瘟病菌总DNA、mRNA的提取及cDNA的制备 | 第15-16页 |
| 3.4.1 稻瘟病菌菌丝体基因组DNA的提取 | 第15页 |
| 3.4.2 稻瘟病菌总RNA的提取 | 第15页 |
| 3.4.3 第一链cDNA的反转录合成 | 第15-16页 |
| 3.5 PCR反应体系 | 第16页 |
| 3.6 酶切反应体系 | 第16-17页 |
| 3.7 酶切载体去磷酸化 | 第17页 |
| 3.8 连接反应体系 | 第17页 |
| 3.9 大肠杆菌（DH5α）感受态的制备及转化 | 第17页 |
| 3.10 酵母感受态制备及酵母转化 | 第17-18页 |
| 3.10.1 酵母感受态的制备 | 第17-18页 |
| 3.10.2 酵母转化方法 | 第18页 |
| 3.11 农杆菌EHA105感受态制备及农杆菌转化 | 第18页 |
| 3.12 Southern杂交 | 第18-20页 |
| 3.12.1 探针标记 | 第18页 |
| 3.12.2 DNA消化及电泳 | 第18页 |
| 3.12.3 转膜 | 第18页 |
| 3.12.4 杂交 | 第18-19页 |
| 3.12.5 洗膜显色 | 第19-20页 |
| 3.13 紫外突变及萎锈灵抗性菌株筛选 | 第20页 |
| 3.13.1 紫外突变 | 第20页 |
| 3.13.2 萎锈灵抗性菌株筛选及测序 | 第20页 |
| 3.14 Mosdi1点突变载体构建及突变体抗性分析 | 第20-21页 |
| 3.14.1 Mosdi1点突变载体构建 | 第20页 |
| 3.14.2 Mosdi1点突变突变体的获得及验证 | 第20-21页 |
| 3.15 定点整合载体pMoC-eGFP的构建及突变体验证 | 第21-23页 |
| 3.15.1 酵母-大肠杆菌-农杆菌穿梭载体pMoC的构建 | 第21页 |
| 3.15.2 定点整合载体pMoC-eGFP的构建 | 第21-22页 |
| 3.15.3 定点整合载体pMoC-eGFP的验证 | 第22页 |
| 3.15.4 农杆菌介导的稻瘟菌转化 | 第22页 |
| 3.15.5 pMoC-eGFP突变体的筛选及验证 | 第22-23页 |
| 3.16 突变体生物学表型分析 | 第23-24页 |
| 3.16.1 突变体在不同培养基上的生长速率 | 第23页 |
| 3.16.2 突变体产孢量测定及孢子形态观察 | 第23页 |
| 3.16.3 突变体孢子萌发及附着胞形成测定 | 第23页 |
| 3.16.4 致病性测定实验 | 第23-24页 |
| 3.16.5 突变体绿色荧光蛋白表达 | 第24页 |
| 3.17 定点整合载体pMoC-eGFP的应用 | 第24-26页 |
| 3.17.1 Southern杂交验证 | 第25页 |
| 3.17.2 RT-PCR验证 | 第25-26页 |
| 4 结果与分析 | 第26-37页 |
| 4.1 稻瘟菌萎锈灵抗性突变体获得及测序 | 第26页 |
| 4.2 Mosdi1点突变载体构建及突变体筛选 | 第26-27页 |
| 4.3 Mosdi1点突变转化子抗药性验证 | 第27-28页 |
| 4.4 定点整合载体pMoC-eGFP构建 | 第28-30页 |
| 4.4.1 酵母-大肠杆菌-农杆菌穿梭载体pMoC的构建 | 第28页 |
| 4.4.2 目的片段扩增与pMoC载体酶切 | 第28-29页 |
| 4.4.3 重组质粒检测 | 第29-30页 |
| 4.5 pMoC-eGFP突变体筛选及验证 | 第30页 |
| 4.5.1 PCR验证 | 第30页 |
| 4.5.2 Southern杂交验证 | 第30页 |
| 4.6 定点整合pMoC-eGFP不影响菌株极性生长 | 第30-31页 |
| 4.7 定点整合pMoC-eGFP不改变菌株产孢能力 | 第31-32页 |
| 4.8 定点整合pMoC-eGFP不影响菌株孢子萌发及附着孢形成能力 | 第32-33页 |
| 4.9 定点整合pMoC-eGFP不改变菌株的致病性 | 第33-34页 |
| 4.10 pMoC-eGFP定点整合突变体中绿色荧光的观察 | 第34-35页 |
| 4.11 高效基因定点整合系统应用可行性研究 | 第35-37页 |
| 5 小结与讨论 | 第37-39页 |
| 参考文献 | 第39-42页 |
| 致谢 | 第42-43页 |
| 附表 | 第43-45页 |
| 作者简介 | 第45页 |
