| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 符号说明 | 第12-13页 |
| 上篇 文献综述 | 第13-29页 |
| 第一章 猪流行性腹泻病毒概述 | 第13-21页 |
| 1 病原学 | 第13-17页 |
| 1.1 病原分类 | 第13-14页 |
| 1.2 形态结构 | 第14-15页 |
| 1.3 理化性质 | 第15页 |
| 1.4 培养特性 | 第15页 |
| 1.5 结构组成 | 第15-17页 |
| 1.5.1 基因组结构 | 第15-16页 |
| 1.5.2 主要结构蛋白及功能 | 第16-17页 |
| 2 流行病学 | 第17-18页 |
| 3 临床症状、发病机理及病理变化 | 第18页 |
| 4 诊断 | 第18-19页 |
| 5 预防与控制 | 第19-21页 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒变异与遗传进化研究进展 | 第21-27页 |
| 1 S基因的变异 | 第21-22页 |
| 2 M基因的变异 | 第22-23页 |
| 3 ORF3基因的变异 | 第23-24页 |
| 4 N基因的变异 | 第24-27页 |
| 第三章 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的研究进展 | 第27-29页 |
| 下篇 研究内容 | 第29-59页 |
| 第四章 原核表达PEDV经典株和流行株S基因N端片段的抗原性比较 | 第29-47页 |
| 1 材料 | 第30-31页 |
| 1.1 病毒、菌株和载体 | 第30页 |
| 1.2 实验动物和血清 | 第30-31页 |
| 1.3 主要试剂 | 第31页 |
| 1.4 主要仪器 | 第31页 |
| 1.5 主要培养基及缓冲液配制 | 第31页 |
| 2 方法 | 第31-39页 |
| 2.1 经典株和流行株S基因5'端的扩增 | 第31-33页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第31-32页 |
| 2.1.2 病毒RNA的提取 | 第32页 |
| 2.1.3 一步法RT-PCR | 第32-33页 |
| 2.2 目的基因琼脂糖凝胶回收 | 第33页 |
| 2.3 pET28a-S661和pET28a-S673重组表达载体的构建及鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.1 pET-28a及目的基因的双酶切 | 第33页 |
| 2.3.2 目的基因和pET-28a载体的连接 | 第33-34页 |
| 2.4 大肠杆菌Top10感受态的制备与转化 | 第34页 |
| 2.4.1 E.coli Top10感受态的制备 | 第34页 |
| 2.4.2 连接产物转化克隆菌株E.coli Top10 | 第34页 |
| 2.5 菌液PCR的鉴定 | 第34-35页 |
| 2.6 重组质粒的提取和双酶切鉴定 | 第35页 |
| 2.6.1 重组质粒的提取 | 第35页 |
| 2.6.2 重组质粒的双酶切鉴定 | 第35页 |
| 2.7 重组质粒转化表达菌株E.coli BL21 | 第35页 |
| 2.8 重组蛋白的表达、表达条件的优化及表达形式的确认 | 第35-36页 |
| 2.9 S661和S673重组蛋白的回收纯化及定量 | 第36-37页 |
| 2.9.1 重组蛋白的回收与纯化 | 第36-37页 |
| 2.10 Western-blotting鉴定 | 第37-38页 |
| 2.11 S661和S673重组蛋白多克隆抗体的制备 | 第38页 |
| 2.12 S基因序列比较分析 | 第38-39页 |
| 2.13 S661和S673重组蛋白反应原性比较 | 第39页 |
| 3 结果 | 第39-45页 |
| 3.1 S基因的扩增 | 第39-40页 |
| 3.2 重组载体pET-28a-S661和pET-28a-S673的双酶切鉴定 | 第40页 |
| 3.3 序列分析 | 第40-42页 |
| 3.3.1 S673序列及进化树分析 | 第40-41页 |
| 3.3.2 S673和S661氨基酸比较分析 | 第41-42页 |
| 3.4 S673和S661抗原性比较分析 | 第42页 |
| 3.5 S661和S673蛋白的表达及最佳表达条件的优化 | 第42-43页 |
| 3.6 表达形式的确认 | 第43页 |
| 3.7 S661和S673重组蛋白的纯化及定量 | 第43-44页 |
| 3.8 表达蛋白的Western-blotting鉴定 | 第44页 |
| 3.9 S661和S673重组蛋白反应原性比较 | 第44-45页 |
| 4 讨论 | 第45-47页 |
| 第五章 原核表达PEDV经典株和流行株S基因N端片段单克隆抗体的制备 | 第47-59页 |
| 1 材料 | 第48-49页 |
| 1.1 细胞和实验动物 | 第48页 |
| 1.2 免疫原 | 第48页 |
| 1.3 主要试剂和仪器 | 第48-49页 |
| 1.3.1 试剂 | 第48页 |
| 1.3.2 仪器与耗材 | 第48-49页 |
| 2 方法 | 第49-54页 |
| 2.1 小鼠的免疫 | 第49页 |
| 2.2 细胞融合 | 第49-51页 |
| 2.2.1 饲养细胞的制备 | 第49页 |
| 2.2.2 骨髓瘤细胞的准备 | 第49-50页 |
| 2.2.3 脾细胞的准备 | 第50页 |
| 2.2.4 细胞融合 | 第50-51页 |
| 2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆 | 第51页 |
| 2.4 杂交瘤细胞的冻存 | 第51页 |
| 2.5 杂交瘤细胞的复苏 | 第51-52页 |
| 2.6 杂交瘤细胞抗体分泌稳定性鉴定 | 第52页 |
| 2.7 腹水的制备 | 第52页 |
| 2.8 杂交瘤细胞上清和腹水效价测定 | 第52页 |
| 2.9 单克隆抗体的Western-blot分析 | 第52-53页 |
| 2.10 单克隆抗体亚类的鉴定 | 第53页 |
| 2.11 抗体叠加试验 | 第53页 |
| 2.12 间接免疫荧光试验 | 第53-54页 |
| 3 结果 | 第54-58页 |
| 3.1 三免后小鼠血清抗体效价测定 | 第54页 |
| 3.2 融合率 | 第54页 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第54页 |
| 3.4 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定 | 第54-55页 |
| 3.5 杂交瘤细胞上清和腹水效价测定 | 第55页 |
| 3.6 单克隆抗体的Western-blot分析 | 第55-56页 |
| 3.7 单克隆抗体亚类的鉴定 | 第56页 |
| 3.8 单克隆抗体抗原识别位点的初步分析 | 第56-57页 |
| 3.8.1 单克隆抗体饱和值的测定结果 | 第56-57页 |
| 3.8.2 叠加ELISA测定McAb作用抗原位点结果 | 第57页 |
| 3.9 间接免疫荧光试验 | 第57-58页 |
| 4 讨论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-67页 |
| 全文总结 | 第67-69页 |
| 附录 | 第69-73页 |
| 致谢 | 第73-75页 |
| 在读硕士学位期间发表的论文 | 第75页 |
