| 摘要 | 第1-11页 |
| 文献综述 | 第11-19页 |
| 1 动物黑色素合成和调节机制 | 第11-13页 |
| ·黑色素的化学本质和合成机理 | 第11-12页 |
| ·黑色素合成的调节机制 | 第12-13页 |
| 2 POMC作用概述和其衍生肽的功能 | 第13-15页 |
| ·ACTH及其功能 | 第14页 |
| ·β-内啡肽及其功能 | 第14页 |
| ·β-MSH、γ-MSH及其功能 | 第14-15页 |
| ·α-MSH及其功能 | 第15页 |
| 3 miRNA的功能作用和研究进展 | 第15-17页 |
| ·miRNA的干扰作用和发现 | 第15-17页 |
| ·miRNA目标基因的预测方法 | 第17页 |
| ·miRNA对毛色调控研究进展 | 第17页 |
| 4 研究的目的和意义 | 第17-19页 |
| 实验一 内源性miR-488及POMC的检测 | 第19-26页 |
| 1 材料 | 第19页 |
| ·RNA提取及常规PCR技术所用试剂及耗材 | 第19页 |
| ·主要仪器设备 | 第19页 |
| 2 方法 | 第19-22页 |
| ·候选miR-488以及预测靶基因POMC的生物信息学分析 | 第19-20页 |
| ·C57BL/6小鼠总RNA的提取 | 第20页 |
| ·小鼠cDNA的合成 | 第20-21页 |
| ·内源性POMC和miR-488的检测 | 第21-22页 |
| ·引物设计 | 第21页 |
| ·PCR反应体系的建立 | 第21-22页 |
| 3 结果和分析 | 第22-24页 |
| ·候选miR-488所调控靶基因POMC生物信息学分析 | 第22-23页 |
| ·小鼠总RNA纯度鉴定 | 第23页 |
| ·内源性POMC和miR-488的检测 | 第23-24页 |
| 4 讨论 | 第24-26页 |
| 实验二 不同毛色小鼠皮肤POMC及miR-488的表达 | 第26-35页 |
| 1 材料 | 第26-27页 |
| ·RNA提取及荧光定量PCR技术所用试剂及耗材 | 第26页 |
| ·蛋白的提取和western bolt技术所用试剂和耗材 | 第26页 |
| ·主要仪器设备 | 第26-27页 |
| 2 方法 | 第27-31页 |
| ·不同小鼠皮肤POMC和miR-488在mRNA水平的表达 | 第27-28页 |
| ·小鼠皮肤总RNA的提取以及cDNA的合成 | 第27页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第27-28页 |
| ·不同毛色小鼠POMC在蛋白水平的表达 | 第28-31页 |
| ·试剂的准备 | 第28-29页 |
| ·小鼠皮肤总蛋白的提取 | 第29页 |
| ·考马斯亮蓝检测总蛋白 | 第29-30页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第30页 |
| ·蛋白质的电转移 | 第30页 |
| ·封闭及杂交 | 第30-31页 |
| 3 结果和分析 | 第31-34页 |
| ·不同毛色小鼠POMC及miR-488在mRNA水平的表达 | 第31-33页 |
| ·不同毛色小鼠POMC及miR-488在mRNA水平的表达扩增曲线结果 | 第31-32页 |
| ·不同毛色小鼠POMC及miR-488在mRNA水平的表达溶解曲线结果 | 第32页 |
| ·不同毛色小鼠POMC及miR-488在mRNA水平的表达量统计结果 | 第32-33页 |
| ·不同毛色小鼠POMC在蛋白水平的表达 | 第33-34页 |
| ·总蛋白考马斯亮蓝的鉴定 | 第33页 |
| ·western bolt检测不同毛色小鼠POMC在蛋白水平的表达 | 第33-34页 |
| 4 讨论 | 第34-35页 |
| 实验三 双荧光素酶报告载体的构建及活性鉴定 | 第35-45页 |
| 1 材料 | 第35-36页 |
| ·双荧光报告检测所用试剂及耗材 | 第35页 |
| ·主要仪器设备 | 第35-36页 |
| 2 方法 | 第36-40页 |
| ·构建POMC双荧光素酶报告载体和miR-488真核表达载体 | 第36-39页 |
| ·引物设计 | 第36页 |
| ·PCR产物回收 | 第36-37页 |
| ·目的条带和载体双酶切 | 第37页 |
| ·基因重组 | 第37-38页 |
| ·质粒提取 | 第38-39页 |
| ·重组质粒共转染HEK293T细胞 | 第39页 |
| ·双荧光报告基因检测 | 第39-40页 |
| 3 结果和分析 | 第40-43页 |
| ·带有酶切位点POMC 3’-UTR的检测及pmirGLO+POMC重组后检测 | 第40-41页 |
| ·pmiGLO-POMC 3'UTR真核表达载体的构建 | 第41页 |
| ·带有酶切位点miR-488检测以及pmscv和miR-488重组后检测 | 第41-42页 |
| ·pMSCV-Puro-miR488真核表达载体的构建 | 第42-43页 |
| ·重组质粒共转染HEK293T细胞 | 第43页 |
| ·双荧光报告检测结果 | 第43页 |
| 4 讨论 | 第43-45页 |
| 实验四 小鼠原代角质形成细胞的培养及转染后鉴定 | 第45-52页 |
| 1 材料 | 第45页 |
| ·小鼠原代角质形成细胞培养所需试剂及耗材 | 第45页 |
| ·质粒中提及细胞转染试剂 | 第45页 |
| ·荧光定量以及western bolt所需试剂及耗材 | 第45页 |
| ·主要仪器设备 | 第45页 |
| 2 方法 | 第45-48页 |
| ·原代小鼠角质形成细胞的培养 | 第45-46页 |
| ·pLV.ExBi.P/Puro-K14-MCS-mouse pri-miR488-MCS-eGFP真核表达载体的构建 | 第46页 |
| ·pLV.ExBi.P/Puro-K14-MCS-mouse pri-miR488-MCS-eGFP质粒转染小鼠角质形成细胞 | 第46页 |
| ·转染后角质形成细胞总RNA的提取和QRT-PCR的鉴定 | 第46-47页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第46-47页 |
| ·荧光定量检测转染后POMC在mRNA的表达 | 第47页 |
| ·转染后角质形成细胞总蛋白的提取和western bolt的鉴定 | 第47-48页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第47-48页 |
| ·western bolt检测转染后POMC的表达 | 第48页 |
| 3 结果和分析 | 第48-50页 |
| ·pLV.ExBi.P/Puro-K14-MCS-mouse pri-miR488-MCS-eGFP真核表达载体的构建 | 第48页 |
| ·小鼠角质形成细胞的形态观察 | 第48-49页 |
| ·转染后角质形成细胞POMC在mRNA水平的检测 | 第49-50页 |
| ·转染后角质形成细胞POMC在蛋白水平的检测 | 第50页 |
| 4 讨论 | 第50-52页 |
| 全文总结 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-59页 |
| Abstract | 第59-61页 |
| 中英文对照及缩写表 | 第61-63页 |
| 致谢 | 第63页 |
