| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1．1 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的特性 | 第11-13页 |
| 1．1．1 病毒的分类及理化性质 | 第11-12页 |
| 1．1．2 细胞培养特性 | 第12页 |
| 1．1．3 致病机制 | 第12-13页 |
| 1．1．4 流行病学 | 第13页 |
| 1．1．5 生物学特性 | 第13页 |
| 1．2 PRRSV的分子生物学研究 | 第13-18页 |
| 1．2．1 基因结构 | 第13-14页 |
| 1．2．2 病毒蛋白 | 第14-15页 |
| 1．2．3 RNA聚合酶 | 第15页 |
| 1．2．4 主要结构蛋白 | 第15-17页 |
| 1．2．5 次要结构蛋白 | 第17页 |
| 1．2．6 PRRSV抗原性变异 | 第17-18页 |
| 1．2．7 PRRSV基因组的变异 | 第18页 |
| 1．3 PRRSV诊断方法的研究 | 第18-21页 |
| 1．3．1 病原学的诊断 | 第18-19页 |
| 1．3．2 血清学诊断 | 第19-21页 |
| 第2章 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 | 第21-36页 |
| 2．1 研究目的及意义 | 第21页 |
| 2．2 材料 | 第21-22页 |
| 2．2．1 抗原、细胞、病毒与动物 | 第21页 |
| 2．2．2 主要试剂 | 第21-22页 |
| 2．3 方法 | 第22-28页 |
| 2．3．1 病毒粒子的大量制备及纯化 | 第22页 |
| 2．3．2 免疫原包涵体GP5蛋白的制备 | 第22-23页 |
| 2．3．3 动物免疫 | 第23页 |
| 2．3．4 SP2/0骨髓瘤细胞的活化 | 第23页 |
| 2．3．5 细胞融合 | 第23-24页 |
| 2．3．6 间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清 | 第24-25页 |
| 2．3．7 杂交瘤细胞的克隆化 | 第25页 |
| 2．3．8 单克隆抗体的生产和效价测定 | 第25页 |
| 2．3．9 间接免疫荧光法检测单克隆抗体 | 第25-26页 |
| 2．3．10 Western-blot分析 | 第26-27页 |
| 2．3．11 交叉试验 | 第27页 |
| 2．3．12 单克隆抗体所针对表位的初步确定 | 第27页 |
| 2．3．13 单克隆抗体的特性检测 | 第27-28页 |
| 2．4 结果分析 | 第28-33页 |
| 2．4．1 病毒的纯化 | 第28页 |
| 2．4．2 细胞融合 | 第28页 |
| 2．4．3 杂交瘤细胞的筛选 | 第28-29页 |
| 2．4．4 Western-blot试验 | 第29页 |
| 2．4．5 免疫荧光试验 | 第29-30页 |
| 2．4．6 小鼠腹水效价的测定 | 第30-31页 |
| 2．4．7 单克隆抗体的亚类鉴定 | 第31页 |
| 2．4．8 交叉试验结果 | 第31页 |
| 2．4．9 与GP5蛋白及其表位缺失体的间接ELISA | 第31-32页 |
| 2．4．10 中和实验 | 第32页 |
| 2．4．11 ADE(抗体依赖性增强)实验 | 第32-33页 |
| 2．5 讨论 | 第33-35页 |
| 2．5．1 动物的免疫 | 第33页 |
| 2．5．2 细胞融合 | 第33页 |
| 2．5．3 筛选 | 第33页 |
| 2．5．4 克隆 | 第33-34页 |
| 2．5．5 杂交瘤细胞的冻存和复苏 | 第34页 |
| 2．5．6 制备PRRSV单克隆抗体的路线选择 | 第34页 |
| 2．5．7 GP5蛋白的表位研究 | 第34-35页 |
| 2．5．8 GP5与PRRSV的ADE现象 | 第35页 |
| 2．6 小结 | 第35-36页 |
| 第3章 胸膜肺炎放线杆菌文献综述 | 第36-41页 |
| 3．1 病原学 | 第36页 |
| 3．2 致病因子 | 第36-38页 |
| 3．3 胸膜肺炎疫苗研究进展 | 第38-41页 |
| 3．3．1 全细菌灭活疫苗 | 第39页 |
| 3．3．2 亚单位疫苗 | 第39页 |
| 3．3．3 弱毒活疫苗 | 第39-40页 |
| 3．3．4 胸膜肺炎Ghosts疫苗 | 第40页 |
| 3．3．5 在核酸疫苗上的探索性研究 | 第40-41页 |
| 第4章 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apx ⅠA基因的核酸疫苗研究 | 第41-64页 |
| 4．1 研究目的及意义 | 第41-42页 |
| 4．2 材料 | 第42-47页 |
| 4．2．1 质粒、菌株、细胞及动物 | 第42-43页 |
| 4．2．2 培养基及抗生素 | 第43-44页 |
| 4．2．3 引物 | 第44页 |
| 4．2．4 酶及试剂盒 | 第44页 |
| 4．2．5 质粒抽提与鉴定试剂 | 第44-45页 |
| 4．2．6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液 | 第45-46页 |
| 4．2．7 Western-blot相关溶液 | 第46页 |
| 4．2．8 ELISA缓冲液 | 第46页 |
| 4．2．9 溶血试验所用溶液 | 第46页 |
| 4．2．10 其他试剂 | 第46-47页 |
| 4．3 方法 | 第47-54页 |
| 4．3．1 细菌的增殖及基因组的提取 | 第47页 |
| 4．3．2 apx ⅠA片段的扩增 | 第47页 |
| 4．3．3 PCR产物的回收与电泳检测 | 第47页 |
| 4．3．4 PCR产物电泳后的回收与纯化 | 第47-48页 |
| 4．3．5 apx ⅠA的测序及常规DNA疫苗表达质粒的构建 | 第48-49页 |
| 4．3．6 “自杀性”DNA疫苗表达质粒pS-apxIA的构建 | 第49-50页 |
| 4．3．7 感受态细胞的制备 | 第50页 |
| 4．3．8 连接产物的转化 | 第50页 |
| 4．3．9 质粒的小量制备 | 第50页 |
| 4．3．10 质粒的大量制备 | 第50-51页 |
| 4．3．11 重组质粒的酶切鉴定 | 第51页 |
| 4．3．12 脂质体介导转化法 | 第51-52页 |
| 4．3．13 G418抗性细胞的筛选 | 第52页 |
| 4．3．14 间接免疫荧光染色法检测外源蛋白在动物细胞中的表达 | 第52页 |
| 4．3．15 Western-blot | 第52页 |
| 4．3．16 天然Apx Ⅰ的提取 | 第52-53页 |
| 4．3．17 毒素Ⅰ溶血活性的测定 | 第53页 |
| 4．3．18 核酸免疫与攻毒保护性试验 | 第53-54页 |
| 4．4 结果与分析 | 第54-62页 |
| 4．4．1 apx ⅠA片段的扩增及酶切鉴定 | 第54-55页 |
| 4．4．2 pcD-apxIA的酶切鉴定 | 第55页 |
| 4．4．3 重组质粒pcD-apxIA的序列测定 | 第55-57页 |
| 4．4．4 中间转移载体pE-apxIA的构建及酶切鉴定 | 第57-58页 |
| 4．4．5 pS-apxIA的构建及酶切鉴定 | 第58页 |
| 4．4．6 pcD-apxIA在Hela细胞中的表达 | 第58-59页 |
| 4．4．7 apx ⅠA基因在BHK-21细胞中的表达 | 第59-60页 |
| 4．4．8 间接ELISA检测免疫小鼠血清的抗体水平 | 第60页 |
| 4．4．9 溶血中和抗体的检测结果 | 第60-61页 |
| 4．4．10 小鼠核酸免疫的攻毒保护试验结果 | 第61-62页 |
| 4．5 讨论 | 第62-63页 |
| 4．5．1 APP的主要保护性抗原基因 | 第62页 |
| 4．5．2 关于猪胸膜肺炎的保护性抗体 | 第62-63页 |
| 4．5．3 关于真核表达载体 | 第63页 |
| 4．5．4 关于猪传染性胸膜肺炎的核酸苗 | 第63页 |
| 4．6 结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-73页 |
| 附录 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
