| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-15页 |
| 前言 | 第15-23页 |
| 第一部分：快速富集与筛选人基因组中的DNA调节片段 | 第23-52页 |
| 材料与方法 | 第23-41页 |
| 一、实验材料 | 第23-24页 |
| 1.细胞系 | 第23页 |
| 2.菌株和质粒 | 第23页 |
| 3.限制性核酸内切酶 | 第23页 |
| 4.修饰酶 | 第23页 |
| 5.寡核苷酸 | 第23页 |
| 6.试剂盒 | 第23页 |
| 7.放射性核素 | 第23页 |
| 8.其它主要试剂 | 第23-24页 |
| 9.主要仪器设备 | 第24页 |
| 二、溶液配制 | 第24页 |
| 三、实验方法 | 第24-41页 |
| 1.实验流程 | 第24页 |
| 2.细胞复苏与培养 | 第24-25页 |
| 3.细胞冻存 | 第25页 |
| 4.K562细胞和Hela细胞核粗提物的提取 | 第25-28页 |
| 5.人基因组DNA的提取 | 第28页 |
| 6.全基因组PCR扩增人基因组DNA | 第28-31页 |
| ·DNA的超声打断 | 第28-29页 |
| ·DNA断片的削平 | 第29页 |
| ·DNA片段的纯化 | 第29页 |
| ·Oligo E的磷酸化和DNA连接子的形成 | 第29-30页 |
| ·连接反应 | 第30页 |
| ·全基因组的PCR扩增与PCR产物的沉淀 | 第30-31页 |
| ·第一轮凝胶阻滞实验用的人基因组DNA探针的制备 | 第31页 |
| 7.聚丙烯酰胺凝胶中DNA的回收 | 第31页 |
| 8.随机寡核苷酸中调节片段的富集 | 第31-34页 |
| ·第一轮凝胶阻滞实验用的随机寡核苷酸探针的标记和回收 | 第31-32页 |
| ·随机寡核苷酸探针与Hela细胞核粗提物的第一轮凝胶阻滞实验 | 第32-33页 |
| ·随机寡核苷酸探针与Hela细胞核粗提物的第二至五轮凝胶阻滞实验 | 第33页 |
| ·富集后寡核苷酸DNA的大量扩增 | 第33-34页 |
| ·五轮凝胶阻滞实验前后含调节元件的寡核苷酸DNA丰度的比较 | 第34页 |
| 9.人基因组中DNA调节片段的富集 | 第34-36页 |
| ·人全基因组PCR产物与K562细胞核粗提物的第一轮凝胶阻滞实验 | 第34-35页 |
| ·人全基因组PCR产物与K562细胞核粗提物的第二至五轮凝胶阻滞实验 | 第35-36页 |
| ·富含调节片段的人基因组的PCR大量扩增与纯化 | 第36页 |
| 10.感受态大肠杆菌的制备 | 第36页 |
| 11.富含人基因组DNA调节片段的部分文库的构建 | 第36-38页 |
| ·富含调节元件的人基因组DNA的酶切消化 | 第36-37页 |
| ·质粒pUC19的限制性消化 | 第37页 |
| ·载体DNA的去磷酸化处理 | 第37页 |
| ·富含调节元件的人基因组DNA与质粒pUC19的连接 | 第37页 |
| ·载体自身连接产物和目的片段多拷贝插入的连接产物的去除 | 第37-38页 |
| ·连接产物转化感受态细菌 | 第38页 |
| 12.含调节元件的人基因组DNA片段的筛选 | 第38-39页 |
| ·单菌落的培养、菌种保存和质粒DNA的小量制备 | 第38页 |
| ·质粒DNA的酶切鉴定 | 第38页 |
| ·插入片段DNA的回收 | 第38-39页 |
| ·捅入片段DNA的放射性核素标记 | 第39页 |
| ·凝胶阻滞实验筛选人基因组DNA调节片段 | 第39页 |
| 13.DNA序列分析 | 第39-40页 |
| 14.DNA上潜在反式作用因子结合位点的分析 | 第40-41页 |
| 第一部分实验结果 | 第41-52页 |
| 一、含调节元件的随机寡核苷肾酸DNA的富集 | 第41页 |
| 二、人基因组DNA的超声打断及全基因组PCR扩增 | 第41-43页 |
| 三、人基因组DNA调节片段的富集 | 第43-44页 |
| 四、从DNA部分文库中筛选人基因组DNA调节片段 | 第44-46页 |
| 五、DNA调节片段的序列分析 | 第46页 |
| 六、DNA调节片段上潜在反式作用因子结合位点的分析 | 第46-52页 |
| 第二部分：筛选人表达序列中的DNA调节片段 | 第52-70页 |
| 材料与方法 | 第52-61页 |
| 一、实验材料 | 第52页 |
| 1.细胞系 | 第52页 |
| 2.菌株和质粒 | 第52页 |
| 3.限制性核酸内切酶 | 第52页 |
| 4.修饰酶 | 第52页 |
| 5.寡核苷酸 | 第52页 |
| 6.试剂盒 | 第52页 |
| 7.磁珠 | 第52页 |
| 8.放射性核素 | 第52页 |
| 9.主要仪器设备及其它主要试剂 | 第52页 |
| 二、溶液配制 | 第52-53页 |
| 三、实验方法 | 第53-61页 |
| 1.实验流程 | 第53页 |
| 2.K562细胞核粗提物的制备 | 第53页 |
| 3.K562细胞总RNA的提取 | 第53页 |
| 4.K562细胞固相cDNA文库的制备 | 第53-58页 |
| ·固相cDNA文库制备的基本原理 | 第53-57页 |
| ·磁珠的去RNase处理 | 第57页 |
| ·生物素标记的oligo (dT)_(36)与磁珠的结合 | 第57页 |
| ·mRNA的纯化 | 第57页 |
| ·固相cDNA文库的合成 | 第57-58页 |
| 5.杂交筛选表达序列中的DNA调节片段 | 第58-59页 |
| ·实验原理 | 第58页 |
| ·K562细胞cDNA文库的预杂交 | 第58页 |
| ·富含调节片段的人基因组DNA与cDNA文库的第一轮杂交、洗涤 | 第58页 |
| ·杂交片段的洗脱与PCR大量扩增 | 第58-59页 |
| ·DNA调节片段与K562细胞cDNA文库的第二轮杂交、洗涤与扩增 | 第59页 |
| 6.富含调节片段的表达序列DNA部分文库的构建 | 第59-60页 |
| 7.人表达序列中DNA调节片段的筛选 | 第60页 |
| 8.DNA序列分析和潜在的反式作用因子结合位点的分析 | 第60-61页 |
| 第二部分实验结果 | 第61-70页 |
| 一、杂交筛选表达序列中的DNA调节片段 | 第61页 |
| 二、DNA调节片段的序列分析 | 第61-68页 |
| 三、DNA调节片段上潜在反式作用因子结合位点的分析 | 第68-70页 |
| 第三部分：筛选具有细胞特异结合模式的DNA调节片段 | 第70-77页 |
| 材料与方法 | 第70-72页 |
| 一、实验材料 | 第70页 |
| 二、实验方法 | 第70-72页 |
| 1.K562细胞和Hela细胞的培养 | 第70页 |
| 2.K562细胞和Hela细胞核粗提物的制备 | 第70页 |
| 3.凝胶阻滞实验比较两种细胞核粗提物与DNA探针的结合模式 | 第70-72页 |
| 第三部分实验结果 | 第72-77页 |
| 讨论 | 第77-87页 |
| 一、利用凝胶阻滞实验筛选DNA调节片段的的基本原理 | 第77-78页 |
| 二、人基因组中DNA调节片段的筛选 | 第78-79页 |
| 三、表达序列中的DNA调节片段的筛选 | 第79页 |
| 四、细胞特异性DNA调节片段的筛选 | 第79-80页 |
| 五、本实验的研究方法与其它DNA调节片段筛选方法的比较及其改进 | 第80-82页 |
| 六、本研究实验条件的优化 | 第82页 |
| 七、应用前景 | 第82-87页 |
| 小结 | 第87-89页 |
| 参考文献 | 第89-94页 |
| 文献综述 | 第94-112页 |
| (一) 真核基因的转录调节及相关复合物 | 第94-105页 |
| (二) 成簇基因的时空表达调控 | 第105-112页 |
| 英文名词及缩写 | 第112-115页 |
| 转录调节研究常用网址 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116页 |
